青光眼的分子遗传学研究目前尚处于初始阶段。虽然已经定位和克隆了一些位点和致病基因，但由于青光眼发病机制不同、临床类型各异，这增加了基因定位、基因克隆和功能鉴定的复杂性。临床上表现为不同类型的青光眼可由同一致病基因引起，如阿克森费耳德里德尔综合征1型和IRID2与PITX2基因;但有时分子上定位于染色体同一位点不同类型的青光眼却不是同一致病基因引起的，如均位于6p25的IRID1和ARA;同一基因可以引起不同的临床特点或综合征，如PAX6基因[1]。从而给临床分型和基因分型造成冲突。青光眼是多基因性疾病，受许多对微效加性基因作用。这些不同基因构成的遗传背景中，可能有易感性主基因起着重要作用。同时还受环境因素的制约，彼此间相互作用错综复杂，所以任一基因的多态性对疾病发生仅起微弱的作用[2,3]。鉴于此，我们对原发性开角型青光眼(POAG)相关基因的单核苷酸多态性(SNP)进行分析，发现与POAG相关的异常SNP位点，以利于阐明POAG的发病机制，早期基因诊断和早期筛选POAG高危人群，特别是伴有高度近视的患者。
1对象和方法
1.1对象 200510/200605中山大学中山眼科中心青光眼专科确诊的POAG患者18例，全部经过Goldmann多次眼压，Humphrey 750型自动视野，海德堡2.01型共焦激光断层扫描仪和前房角镜检查。伴高度近视者，经自动验光仪检查和小瞳验光，确定屈光度数和矫正视力。POAG诊断标准参考1987年全国青光眼学组推荐的标准[4]。1)眼压 > 21mmHg (Goldmann 压平眼压测量);2)青光眼性视盘生理凹陷扩大(C/D >0.6或双眼差 >0.2);3)青光眼性视野损害;4)视网膜神经纤维层缺损;5)前房角检查为宽角。对照病例为广州市第十二人民医院体检的健康者，无眼病史和青光眼家族史。POAG组9例(男7，女2)，年龄28.9(14～54)岁，起病年龄15～36岁;均无近视家族史，屈光度数值 ≤3.00D;患眼矫正视力无光感～1.5，青光眼性视野损害早期～晚期，眼压28～50mmHg (Goldmann)。高度近视合并POAG组9例(男4，女5)，年龄34.8(23～55)岁，起病年龄20～50岁;其中4例有高度近视家族史，近视屈光度数值 ≥8.00D;患眼矫正视力眼前手动～1.5，青光眼性视野损害早期～晚期，眼压25～60 mmHg (Goldmann)。正常对照组100例(男47，女53)，年龄58.3(50～70)岁。
1.2方法 通过计算机网上检索中国期刊全文数据库(CNKI)和“外文生物医学期刊全文服务系统”(http://192.168.2.10:8080/fmjs/index.jsp)，库内已发表的相关文献作为资料来源。选出与POAG相关的因子：白介素6，白介素6受体，多巴胺受体D2，β纤维蛋白原，过氧化物酶体增殖物激活受体γ2，转化生长因子β1，和E选择素及相应的单核苷酸多态性序列号(dsSNP ID)[3-9](表1)。通过GenBank的dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)和TSC(The SNP Consortium)数据库(http://snp.cshl.org/)查询，得到相关基因的SNP、位置、和错义翻译(表1)。抽取静脉血1.5mL，25g/L EDTA抗凝。基因组DNA抽提采用基因组DNA小量抽提试剂盒(上海生工生物工程公司提供)，对实验方法作适当的修改。所得DNA样本20℃保存。应用ABI Prism 7500HT型荧光定量PCR结合TaqMan SNP Genotyping试剂盒荧光探针技术进行检测，实验结果由随机附带软件作出等位基因分布图后判断。实时定量PCR采用ABI Prism 7500HT型荧光定量PCR仪。PCR反应体系为25μL，包括2×Universal PCR Master mix 12.5μL;40×Probe/Primer mix 0.625μL;dATP，dCTP，dGTP，dUTP共1μL;加水10.875μL。Primer/Probe Mix含6FAM 探针(200nmol/L)，VIC探针(200nmol/L)，正向引物(900nmol/L)，和反向引物(900nmol/L)。FAM与VIC探针分别对应于两种多态或正常与突变基因(表2)。PCR循环条件：预变性50℃ 2min → 95℃10min后，92℃ 30s → 60℃ 60s，进行40个循环。每次检测至少设3个空白对照。读取PCR后的终点荧光信号，应用SDS软件v1.0数据分析。检测结果的荧光分布表现为：图谱中的每一个x代表一个标本，X轴代表VIC探针荧光，Y轴代表FAM探针荧光，原点处为空白对照，对角线处为杂合子。根据图谱，选择对应的等位基因类别，显示基因分型结果。
统计学处理：用SPSS11.5软件包进行分析。基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，各组间基因型及等位基因频率比较采用卡方检验，P<0.05为有统计学意义。
2结果
通过TSC数据库查询，得到的POAG相关基因SNP位点的亚洲人群各基因类型频率(表3)和等位基因频率(表4)。
表1 POAG相关基因的序列号，位置和错义翻译(略)
表2 实时定量荧光PCR的探针序列(略)
表3 各亚洲人SNP的基因类型频率(略)
表4 各SNP的亚洲人等位基因频率(略)
2.1 SNP的等位基因频率 DRD2的A等位基因仅见于POAG伴高度近视组。POAG组未见IL6R的C和ESel的T等位基因。在POAG组及POAG伴高度近视组，IL6的C等位基因频率(55.6%，22.2%)显著高于正常组(4.0%)和亚洲人(6.8% ～ 2.3%);TGFβ1的A等位基因频率(11.1%)略低于正常组(21.0%)和亚洲人(46.3% ～ 47.7%)。POAG组中DRD2和FGB的G等位基因频率(66.7%)分别显著和略高于POAG伴高度近视组(22.2%，44.4%);PPARG的C等位基因频率(44.4%)略高于POAG伴高度近视组(11.1%)，正常对照组(15.0%)和亚洲人群(16.3%，表5)。
2.2等位基因频率和错义表达 POAG组内同时DRD2和FGB出现错义表达的占44.4%(4例)，而POAG伴高度近视组仅11.1%。POAG组内同时表现5个位点SNP的占33.3%(3例)，而POAG伴高度近视组为44.4%(4例)。有1例POAG伴高度近视患者呈现唯一的DRD2 A等位基因和唯一的IL6R基因错义表达SNP(表6)。
3讨论
对于POAG这种多基因相关的复杂疾病，单个的相关SNPs等位基因对POAG来说是不够的。POAG可能是多个关键基因内的SNPs联合作用加环境因素而导致的。这些基因的相互作用可以是相加的，协同的或拮抗的。我们分析了与青光眼性视神经视网膜功能损害相关的IL6，IL6受体，过氧化物酶增生物激活受体基因的相关SNP等位基因;与小梁组织功能有关的E选择素和转化生长因子β1基因的相关SNP等位基因;与缺血性青光眼性视网膜视神经损害有关的纤维蛋白原相关SNP等位基因;与眼压调节和眼轴生长发育有关的多巴胺受体D2相关SNP等位基因。结果表明，在POAG组及POAG伴高度近视组，IL6的C等位基因频率(55.6%，22.2%)显著高于正常组(4%)和亚洲人(6.8% ～ 2.3%);POAG组未见IL6R的C等位基因。有研究显示大约30%的正常眼压青光眼患者同时有自身免疫缺陷性疾病，如干燥综合征、关节炎、甲状腺炎及血清中抗异型蛋白抗体水平增高。正常眼压青光眼患者血清中抗热休克蛋白抗体水平明显增高，部分POAG患者的血清对抗热休克蛋白抗体也呈现较高水平的表达[12]。提示免疫因素在POAG的发病机制中占有重要因素。IL6生成水平的下调与数种疾病相关联，并在多种自身免疫性疾病发病机制中扮演重要角色。对IL6的内源性神经保护机制研究中发现，缺血再灌注损伤后视网膜内的IL6以及IL6R水平均有所上调。当在玻璃体腔内注射外源性IL6后视网膜神经节细胞凋亡明显减少。POAG患者很可能因体内内源性IL6的减少，通过激活酪氨酸酶进而激活信号转导及转录活化因子3水平降低，使靶基因Bcl2和BclXL表达下降，从而使视网膜节细胞的凋亡增加。
过氧化物酶增生物激活受体(PPAR γ)是噻唑烷二酮类(TZDs)的靶目标，在视网膜中也有表达，TZDs(罗格列酮、吡格列酮)激动PPAR γ后，可以抑制谷氨酸的细胞氧化作用，并抑制硫化物的毒性作用，以保护视网膜神经节细胞免受POAG的损害[9]。本结果表明，POAG组中PPARG的C等位基因频率(44.4%)略高于POAG伴高度近视组(11.1%)，正常对照组(15%)和亚洲人群(16.3%)。可能PPARG的C等位基因表达影响PPAR γ的活性功能。
POAG的发生常常是由于小梁组织和生理功能的改变。本结果POAG组未见ESel的T等位基因。E选择素有可能通过对细胞骨架的作用，控制小梁细胞形态，调控眼压，并在青光眼的发生、发展过程中起作用。体外研究发现，TGFβ1可促进小梁的胶原、纤维连接蛋白和透明质酸等细胞外基质堆积，引起房水外流阻力显著升高，引发POAC[13]。在一定范围内，TGFβ1上调培养的小梁细胞微丝肌动蛋白，使细胞收缩与运动能力适当增强，利于房水引流;但如果细胞收缩与运动能力过度增强，使小梁网挛缩，失去弹性，网孔闭锁，则不利于房水引流，可使眼压升高，导致POAG发生。本文结果表明，POAG组及POAG伴高度近视组，TGFβ1的A等位基因频率(11.1%)略低于正常组(21%)和亚洲人(46.3% ～ 47.7%)。说明TGFβ1的A等位基因很可能与POAG的发生与发展密切相关。同时，POAG隶属于“高粘滞血症”的概念，其全血比粘度、血浆比粘度、红细胞压积、纤维蛋白原均较正常对照组有显著性升高[14]。正常微循环中血管直径和灌注压的自动调节起主要作用，血液粘度仅起次要作用。在血管舒缩储备力耗竭时，轻微血液粘滞性的增加将会变成支配血流关键而有限的因素。血粘度增加时，血管将扩张以维持正常的血液循环。若此时眼压升高，阻碍血管扩张或造成血管狭窄，则血流率下降并造成缺血，就视乳头而言，将造成青光眼性视神经损害。在POAG组中FGB的G等位基因频率(66.7%)略高于POAG伴高度近视组(44.4%)和正常对照组(46%)。可能FGB的G等位基因错义表达，引起血液粘度增加，加重POAG的缺血性视网膜视神经损害。
表5 POAG，POAG伴高度近视SNP等位基因频率(略)
表6 各SNP等位基因在POAG和POAG伴高度近视病例的分布(略)
随着光学相干断层成像仪、共焦激光扫描眼底镜、超声生物显微镜等高新技术的应用，越来越多的青光眼患者得到了早期诊治。但由于近视眼的视杯较大和巩膜脉络膜在鼻侧过度牵引影响生理凹陷的判断;近视弧扩大影响视盘萎缩判断。加上，伴有近视的POAG视野改变不典型;高度近视者视力敏感性减退;和巩膜硬度较低使眼压测量结果偏低;干扰了高度近视中POAG的诊断。在本研究中，POAG组内同时DRD2和FGB出现错义表达的占44.4%(4例)，而POAG伴高度近视组仅11.1%。POAG组中DRD2的G等位基因频率(66.7%)显著高于POAG伴高度近视组(22.2%)。DRD2的A等位基因仅见于POAG伴高度近视组。多巴胺是体内合成肾上腺素和去甲肾上腺素的提前物，是脊椎动物视网膜的主要神经活性物质之一[15]。对中学生血清中多巴胺含量的测定表明，无论是轻度还是中度近视，其血清中多巴胺含量均明显低于正常对照组。动物实验证明，多巴胺活化剂阿朴吗啡能明显抑制形觉剥夺眼眼轴过度延长，且呈剂量依赖性，而多巴胺受体对抗剂氟呱丁苯能促进形觉剥夺眼眼轴延长。同时，无论是局部用药或全身用药，多巴胺均可使正常人眼压下降[7]。因此，多巴胺参与了复杂的眼轴生长调节过程和眼压调控过程。由此推测，DRD2的SNP，特别是DRD2的A等位基因也可能与POAG伴高度近视有关。
经过对POAG相关基因的多个SNP位点检测分析，发现POAG和POAG伴高度近视患者呈多达5～6个位点的SNP改变，包括IL6R，DRD2和FGB基因的错义表达。其中一例POAG伴高度近视患者呈现唯一的DRD2 A等位基因和唯一的IL6R基因错义表达SNP。同时发现，POAG和POAG伴高度近视患者表现多个SNP等位基因的异常频率。结果表明，与青光眼性视神经视网膜功能损害相关的IL6，IL6R和PPARG基因，小梁组织功能相关的ESEL和TGFβ1基因，缺血性视神经视网膜损害相关的FGB基因;与眼压调节和眼轴生长发育相关的DRD2基因的SNP在POAG的发生与发展中起着相关联的作用。由于病例数不足，本文结果需要进一步大样本的研究，来证实和阐明。
本文来自: 中国眼网(www.eyenet.com.cn) 详细出处参考：http://www.eyenet.com.cn/columns/news/30474.html
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