对小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态中作用的研究

作者：张凡孙保存常永霞赵秀兰

【摘要】目的：利用小鼠移植瘤模型动态观察CD31、MMP2、MMP9、CathepsinD在恶性黑色素移植瘤血管生成拟态形成中的作用。方法：采用B16黑色素瘤细胞株制作小鼠恶性黑色素移植瘤动物模型，成瘤后根据随机数字表每天随机抽取一只小鼠处死，共12d，获得肿瘤样本114例；HE染色、CD31、CathepsinD、MMP2、MMP9、HMB45免疫组织化学染色和PAS染色；分别计数血管生成拟态周围及远离血管生成拟态区域肿瘤细胞中阳性细胞百分率；内皮依赖性血管周围及远离内皮依赖性血管区域肿瘤细胞中阳性百分率；连续计数10个高倍视野并取其均值。结果：在恶性黑色素移植瘤形成的第1～8天，肿瘤组织内存在血管生成拟态；第9～12天移植瘤中的血管生成拟态被内皮依赖性血管替代；血管生成拟态周围肿瘤细胞中CD31、MMP2阳性细胞百分率高于远离血管生成拟态区域的阳性细胞百分率;内皮依赖性血管周围肿瘤细胞CD31阳性细胞百分率与远离内皮依赖性血管区域的阳性细胞百分率之间存在明显差别；血管生成拟态周围肿瘤细胞MMP9阳性细胞百分率高于内皮依赖性血管周围的阳性细胞百分率；血管生成拟态密度与血管生成拟态周围肿瘤细胞CD31、CathepsinD、MMP2阳性细胞百分率之间存在相关，与肿瘤细胞中MMP9阳性细胞百分率之间不存在相关；内皮依赖性血管密度只与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞中CD31阳性百分率之间存在相关，与CathepsinD、MMP9、MMP2之间不存在相关。结论：恶性黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态与内皮依赖性血管共存，且与内皮依赖性血管之间存在一定的时空变化规律。CD31、CathepsinD、MMP2、MMP9、HMB45等参与了黑色素瘤血管生成拟态的形成，其中CD31、MMP2作用尤其重要。

【关键词】血管生成拟态;肿瘤血管生成;细胞粘附分子;恶性黑色素瘤;基质金属蛋白酶

【ABSTRACT】Objective:TostudytheeffectivenessofCD31、MMP2、MMP9、CathepsinDonVasculogenicmimicryinthemelanomatransplanttumour.Methods:ThemousemelanomatransplanttumormodelofmousewasmadewithB16melanomacellsuspendingliquid.Whentumorappears,wechooseonemouseeachdayrandomlyaccordingtorandomnumberchartandkillit.Wegettumorspecimensof114casestotally;whichnormallywillhaveHEstainCD31、CathepsinD、MMP2、MMP9、HMB45immunohistochemistrystainandPASstain.ThenrespectivelycountthepercentageofpositivecellsintumoraroundtheVasculogenicmimicryandthepercentageofpositivecellsintumorwhichisfarawayfromtheVascuolgenicmimicry;countthepercentageofpositivecellsintumoraroundtheendothelialdependedvesselandthatofpositivecellsintumorwhichisfarawayfromtheendothelialdependedcell.Results:TheVasculogenicmimicryandendothelialdependedvesselcoexistinthetumortissueattheearlyphaseofmelanoma（d1d8）;Fromday9today12,thisstructureisreplacedbytheendothelialdependedvessel.ThenumberofCD31、MMP2positivecellaroundvasculogenicmimicryismorethanthatofthetumorwhichisfarawayvasculogenicmimicry.TheratioofCD31positivecellaroundendothelialdependedvesselhassignificantdifferencewiththatoftumorfarawayfromit.ThenumberofMMP9positivecellaroundvasculogenicmimicryismorethanthatoftumoraroundendothelialdependedvessel.TherearecorrelationbetweenvasculogenicmimicrydensityandthenumberofCD31、MMP2positivecellsaroundvasculogenicmimicry,whilethedensityofendothelialvesselhascorrelationwiththenumberofCD31positivecellaroundendothelialdependedvessel.ButthedensityofendothelialdependedvesselhavenocorrelationwiththenumberofMMP2、MMP9、CathepsinDpositivecellaroundendothelialvessel.Conclusion:Thevasculogenicmimicryisonesortofspecialbloodprovidingpattern.TheCD31、CathepsinD、MMP2、MMP9alltakepartinthedevelopmentofvasculogenicmimicryandCD31、MMP2playkeyroleinthisprocess.

【KEYWORDS】Vasculogenicmimicry;Angiogenesis;Celladhesionmolecule;Malignantmolenoma;Matrixmetalloproteinase

血管生成拟态是1999年美国lowas大学的Maniotis和Folberg等根据他们对眼葡萄膜恶性黑色素瘤微循环的研究结果，发现的一种与传统的肿瘤血管生成途径完全不同的、不依赖内皮细胞的全新的肿瘤细胞的血液供应方式[1～6]。恶性黑色素瘤细胞通过自身变形和与细胞外基质相互作用，模拟血管壁结构形成可输送血液的管道，从而重塑肿瘤的微循环，并且与宿主血管相连通，使肿瘤获得血液供应，命名为血管生成拟态。这种特殊的肿瘤血供模式与内皮依赖性血管的生成在很多方面存在不同。研究证实具有血管生成拟态的肿瘤恶性度高，生长迅速，易发生血道转移。

本研究在以前实验的基础上首次提出了血管生成拟态的时空变化概念：即血管生成拟态是肿瘤血液供应的一种暂时性替代模式，在肿瘤发生发展的一定时期内存在，在肿瘤的不同区域存在不同的变化趋势。本研究的前期实验通过小鼠的恶性黑色素移植瘤模型，初步验证了我们提出的假说。本实验利用免疫组织化学方法对血管生成拟态的形成机制以及与内皮依赖性血管之间的联系做进一步的探讨，深入揭示两者之间的变化规律。

1材料和方法

1.1实验动物：C57小鼠购自北京军事医学科学院动物室，6～8周龄，共20只，雌雄各半，体重25～30g，编号后洁净实验室饲养，饮用水和饲料由天津医科大学实验动物中心提供。

1.2实验方法：先将黑色素瘤细胞株B16复苏，1640细胞培养基上培养6d，使细胞排满瓶底，0.2%胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度达到1×107/ml。75%酒精消毒小鼠鼠蹊部，每只小鼠鼠蹊部皮下注射0.2ml细胞悬液。10d后接种部位开始出现皮下肿块。根据随机数字表每天抽取一只小鼠处死，共持续12d。解剖并仔细检查动物全身，共获得肿瘤样本114例。全部标本均经10%福尔马林固定，然后常规石蜡包埋。

1.3染色方法

1.3.1试剂：一抗CD31、HMB45为鼠抗小鼠单克隆抗体，即用型，6ml包装，SNATACRUZ生产，进口分装；CathepsinD、MMP2、MMP9兔抗多克隆抗体，浓缩型，0.1ml包装，购自武汉博士德试剂公司；二抗、三抗为SP复合物和山羊抗兔PV6001，购自北京中山试剂公司。PAS液为天津肿瘤医院病理室自行配制。

1.3.2主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗，抗原微波热修复，正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗、三抗各1hDAB显色10～15min，复染核脱水透明，中性树胶封片。

1.3.3CD31、PAS双重染色：先挑选2例正常胃粘膜样本进行对照染色，分泌粘液处均染成樱桃红色，证实PAS试剂质量可靠。先按照SP法进行CD31免疫组织化学染色，DAB显色后显微镜下观察，待血管内皮细胞着棕黄色后水冲数分钟终止显色，然后用0.5%高碘酸溶液还原切片10min，时间切不可过长以避免出现假阳性结果。水流冲洗数分钟后置于schiff液中，避光10～15min，自来水冲洗，显微镜下观察出现樱桃红色，苏木素浅染细胞核，盐酸酒精分化，氨水返蓝后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4计算机图象处理

使用空军总医院医学工程研究所的BINDAFIMG图象采集处理系统计算每张切片中坏死面积。

1.5计数方法

1.5.1区域划分：中央区与外周区的划分：避开肿瘤坏死,将每张切片中肿瘤组织镜下视野均匀分成三等份，即内1/3、中1/3、外1/3三个区域，内1/3区域即为中央区，外1/3即为外周区。血管生成拟态周围与远离血管生成拟态、内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的划分：以血管生成拟态、内皮依赖性血管为中心的高倍视野定义为血管生成拟态、内皮依赖性血管周围；距离上述视野一个高倍视野的肿瘤细胞即为远离血管生成拟态和内皮依赖性血管。血管生成拟态判断标准：无内皮细胞衬复的PAS阳性管道、衬复PAS阳性物质的肿瘤细胞围成不规则管腔，且管腔内存在红细胞，周围没有出血坏死和炎症细胞浸润。

1.5.2计数方法：低倍镜下找到血管生成拟态和内皮依赖性血管存在的典型区域，换成高倍镜（×400），连续计数10个高倍视野内的血管生成拟态、内皮依赖性血管，取其均值即为血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度。同时计数血管生成拟态周围、内皮依赖性血管周围、远离血管生成拟态、远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞中各种指标阳性细胞数（各项指标均连续计数10个高倍视野，每个视野内随机计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其均值）。

1.6统计学处理：

应用SPSS10.0统计软件包对该实验资料进行数据处理，所有数据均为非正态分布，故实验中所有数据均用中位数表示。两样本之间作MannWhitney非参数检验。血管生成拟态周围各指标的表达与血管生成拟态密度、内皮依赖性血管周围各指标的表达与内皮依赖性血管密度之间做相关分析，血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度与肿瘤坏死之间做相关分析。以P<0.05为具有统计学意义。

2.1常规形态学观察

肿瘤直径1.5mm～4mm，大体为黑色，表面可见丰富的血管，与周围宿主组织分界不清，呈浸润生长，切面呈黑红色,实性、质地柔软有光泽，部分区域散在出血坏死。可见肿瘤细胞围成的不规则的管腔，腔内可见红细胞，即血管生成拟态，而且与内皮依赖性血管共存现象，共26例。内皮依赖性血管多位于移植瘤外周区并与正常组织相交界。中央区血管生成拟态较多见，外周区血管生成拟态较少。早期肿瘤坏死较少，且多为点状坏死、局灶性坏死，后期肿瘤组织中央出现区域坏死，将肿瘤组织分割成多个孤立的细胞巢。

2.2肿瘤组织内的血管生成拟态的形态学特点

通过CD31和PAS双重染色，在该移植瘤的第1～8天可见到典型的血管生成拟态样结构：外层为CD31染色阴性的肿瘤细胞，内衬樱桃红色的PAS阳性物质，管腔内有成堆的红细胞,这种结构在第9～12天被内皮依赖性血管所替代。我们的实验中还发现有的血管生成拟态中肿瘤细胞围成的不规则管腔内无PAS阳性物质衬复，同时管腔内存在红细胞。我们以前实验证实人恶性黑色素瘤细胞能表达内皮细胞抗原CD31和PAS阳性物质。本实验中也发现类似现象,镜下观察可发现CD31抗原位于肿瘤细胞胞浆内，呈均质或细颗粒状,且呈现高表达。PAS阳性物质则呈颗粒状或团块状散布在肿瘤细胞胞浆内，甚至有的单个肿瘤细胞外周有一层PAS阳性物质环绕，或几个肿瘤细胞外有一圈PAS阳性物质。

2.3各种指标在肿瘤不同区域的表达变化规律

2.3.1CD31在肿瘤不同区域的表达

显微镜下观察发现部分的肿瘤细胞表达CD31抗原，同时围成血管生成拟态的肿瘤细胞不表达或极少表达CD31抗原，血管生成拟态周围的肿瘤细胞高表达CD31抗原。统计学分析显示：血管生成拟态周围的肿瘤细胞CD31的表达高于远离血管生成拟态肿瘤细胞的表达，内皮依赖性血管周围肿瘤细胞的CD31表达高于远离内皮依赖性血管肿瘤细胞的表达，血管生成拟态周围肿瘤细胞CD31的表达与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞表达之间差别无统计学意义（见表1）。表1CD31在肿瘤不同区域的表达（个/高倍视野）

区域肿瘤数中位数ZAsympsig①血管生成拟态周围区262.5①②―6.1910.001②远离血管生成拟态区261.5③④―5.4390.003③内皮依赖性血管周围区1143.0①③―3.1500.250④远离内皮依赖性血管区1141.7

2.3.2MMP2在肿瘤不同区域的阳性表达

血管生成拟态周围肿瘤细胞MMP2表达高于远离血管生成拟态的肿瘤细胞的表达；内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞MMP2的阳性表达之间差别无统计学意义，血管生成拟态周围肿瘤细胞MMP2的表达与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞表达之间差别无统计学意义（见表2）。

2.3.3MMP9在肿瘤不同区域的表达

血管生成拟态周围肿瘤细胞与远离血管生成拟态肿瘤细胞MMP9的表达之间差别无统计学意义，内皮依赖性血管与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞的MMP9表达之间差别无统计学意义，血管生成拟态周围的肿瘤细胞MMP9的阳性表达高于内皮依赖性血管周围肿瘤细胞的表达（见表3）。

2.3.4CathepsinD在肿瘤不同区域的阳性表达

血管生成拟态周围肿瘤细胞与远离血管生成拟态的肿瘤细胞CathepsinD的表达差别无统计学意义，内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞CathepsinD表达差别无统计学意义，血管生成拟态周围的肿瘤细胞CathepsinD的表达高于内皮依赖性血管周围的肿瘤细胞的表达（见表4）。表2MMP2在肿瘤不同区域的阳性表达（个/高倍视野）表3MMP9在肿瘤不同区域的阳性表达（个/高倍视野）表4CathepsinD在肿瘤不同区域的阳性表达（个/高倍视野）

2.4血管生成拟态密度与血管生成拟态周围肿瘤细胞各免疫组化指标之间的相关分析表5血管生成拟态密度与周围肿瘤细胞阳性表达的相关分析从上表我们可以看出血管生成拟态密度与其周围肿瘤细胞CD31、MMP2的阳性表达之间存在密切相关，与其周围肿瘤细胞CathepsinD、MMP9的阳性表达之间不存在相关。

2.5内皮依赖性血管密度与周围肿瘤细胞各免疫组化指标之间的相关分析

从下表可以看出，内皮依赖性血管密度与其周围肿瘤细胞CD31表达之间存在相关，与其它指标之间不存在相关（见表6）。表6内皮依赖性血管密度与周围肿瘤细胞阳性表达的相关分析

2.6血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度和肿瘤坏死之间的关系

显微镜下观察我们可以看到，早期肿瘤组织内血管生成拟态密度较高，坏死较少见，多为小灶性坏死，后期肿瘤组织内血管生成拟态密度降低，坏死逐渐增多，且多为片状坏死，统计学分析显示，血管生成拟态密度与肿瘤组织的坏死之间存在相关，相关系数r=-0.978，内皮依赖性血管密度与肿瘤坏死之间亦存在相关，相关系数r=-0.230，证明在该肿瘤中血管生成拟态对维持肿瘤生长起到重要作用（见表7）。表7血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度与坏死之间的相关

血管生成拟态是一种全新的、没有内皮细胞参与的肿瘤血液供应模式，已有的研究证实多种肿瘤（炎性乳癌、浸润性卵巢癌、前列腺癌）中存在血管生成拟态。同时研究发现由于这些肿瘤血液供应的特殊性，能够便利克服肿瘤快速生长过程中的缺血、缺氧状况，恶性程度高、生长迅速、极易发生血道转移，因此深入研究血管生成拟态的分子机制对上述肿瘤的抗血管治疗具有重要意义。

我们的研究中发现血管生成拟态只是在恶性黑色素移植瘤的一段时期内与内皮依赖性血管共存，说明该结构是一种暂时性的血液供应模式，与内皮依赖性血管之间存在一定的演变规律，我们首次提出了血管生成拟态的时空变化概念，前期实验部分验证了我们的假说。

肿瘤血管形成是在多种促血管生成因子的刺激下，肿瘤血管生成开关机制失衡，内皮细胞由静止转化为活化状态，突破基底膜，降解细胞外基质，增生形成内皮细胞条索，然后通过基质重塑形成完整的血管网。血管生成拟态则是肿瘤细胞利用自身的变形，模拟内皮细胞相互连接粘附，并与细胞外基质相互作用，借助多种蛋白酶的作用使局部细胞外基质重塑，形成由肿瘤细胞彼此连接的不规则管腔，我们实验中的PAS染色有力的证明肿瘤细胞模拟内皮依赖性血管的结构。尽管两者形成的机制有所不同，但是两者的形成过程中都涉及到细胞表面的粘附分子和与肿瘤浸润转移存在密切关系的蛋白酶类。国外的文献报道证实：能形成血管生成拟态的恶性黑色素瘤细胞的细胞粘附分子（血管-内皮细胞钙粘附蛋白）、基质金属蛋白酶类（MMP2、MT1-MMP）表达水平在形成血管生成拟态的区域内升高。我们的实验就是通过免疫组化检测血管生成拟态周围和内皮依赖性血管周围肿瘤细胞表面粘附分子（CD31）和蛋白酶类（MMP2、MMP9、组织蛋白酶D等）的表达，研究内皮依赖性血管和血管生成拟态在肿瘤发生发展过程中的变化，同时进一步深入研究和完善血管生成拟态的分子机制。