盘状红斑狼疮皮损角质形成细胞的蛋白组学初步分析

盘状红斑狼疮皮损角质形成细胞的蛋白组学初步分析推荐到首页　□　《中山大学学报（医学科学版）》2008年第06期1/3页123作者单位：中山大学附属第二医院皮肤科，广东广州

【摘要】【目的】建立盘状红斑狼疮皮损和正常皮肤角质形成细胞的双向电泳图谱，分析两者蛋白质的表达差异及特点。【方法】运用固相ｐｈ梯度双向凝胶电泳分离６例盘状红斑狼疮患者皮损及正常皮肤角质形成细胞总蛋白，考马斯亮蓝染色后用ｉｍａｇｅｍａｓｔｅｒ２ｄ图象软件比较分析，识别差异蛋白。【结果】盘状红斑狼疮皮损和正常对照电泳图谱平均蛋白点分别为１５６６±３２和１６８２±３８，平均匹配点数为１２８６±１４和１３１４±２１，匹配率为８２．１２％和７８．１２％。分辨差异蛋白点共２２个，１１个在皮损高表达，２个在皮损组低表达，有５个点仅在病例组表达，４个点仅在正常对照组表达。【结论】成功获得分辨率高且重复性较好的蛋白质组双向电泳图谱，识别重复表达的差异蛋白，为后续蛋白功能研究奠定基础。

【关键词】盘状红斑狼疮；角质细胞；蛋白质组

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ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｉｓｃｏｉｄ；ｌｕｐｕｓ；ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ；ｐｒｏｔｅｏｍｅ

［ｊｓｕｎｙａｔ-ｓｅｎｕｎｉｖ（ｍｅｄｓｃｉ），２００８，２９（６）：７４９－７５２］

盘状红斑狼疮（ｄｉｓｃｏｉｄｌｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ，ｄｌｅ）是一种皮肤黏膜的慢性结缔组织疾病，多认为是一种自身免疫性疾病，可能与遗传因素和多种刺激因素有关。关于ｄｌｅ的发病机制目前尚未完全明了。以往大量研究提示角质形成细胞介导的异常免疫反应在狼疮皮损的发生发展过程可能起主导作用［１－２］。为进一步探讨角质细胞在ｄｌｅ发病中异常蛋白的表达，我们对ｄｌｅ皮损及正常皮肤组织角质形成细胞总蛋白进行双向凝胶电泳分离，并采用ｉｍａｇｉｎｇｍａｓｔｅｒ２ｄ图像分析软件对图像进行背景消减、斑点检测、匹配、斑点位置重复性的系统分析，从整体水平寻找差异表达蛋白。

１材料与方法

１．１．１标本皮肤组织来自本院皮肤科门诊ｄｌｅ临床确诊患者，要求病史在６月以上，近两月未服用影响免疫、结缔组织代谢药物。局麻下常规活检，组织一分为二，一部分送病理检查。患者共６例（男性４例，女性２例），年龄２１～４５岁，平均年龄３６岁，病理确诊为ｄｌｅ；另外选择性别和年龄相配的健康志愿者正常皮肤为对照组。

１．１．２主要设备等电聚焦电泳系统（ｅｔｔａｎｉｐｇｐｈｏｒｉｉ）、大型垂直电泳系统（ｅｔｔａｎｄａｌｔｓｉｘ）、图象扫描仪，ｉｍａｇｉｎｇｍａｓｔｅｒ２ｄ５．０图像分析软件均为瑞典ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司产品；

１．１．３试剂胰酶、角质细胞无血清培养基、ｐｂｓ、ｄｉｓｐａｓｅ购自ｇｉｂｃｏ公司；蛋白质定量试剂盒、ｉｐｇ胶条、尿素、ｃｈａｐｓ、ｓｄｓ、ｔｒｉｓ、丙烯酰胺、ｔｍｅｄ、过硫酸铵、三氟乙酸甘油、甘氨酸、溴酚蓝、琼脂糖、考马斯亮蓝ｒ-２５０均为瑞典ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司产品。

１．２．１原代角质细胞培养手术切取患者皮损及正常皮肤３～４ｃｍ２置于ｐｂｓ中，剪成０．５ｃｍ×０．５ｃｍ大小，移入０．２５％ｄｉｓｐａｓｅ。４℃过夜，次日剥取表皮层移入０．２５％胰酶，３７℃孵育１５ｍｉｎ终止消化。筛网滤过，收集细胞。以无血清培养基调定（１～２）×１０６／ｍｌ细胞，苔盼蓝染色计数活细胞，接种于培养瓶中，在３７℃，体积分数为５％ｃｏ２，９０％湿度条件下培养。

１．２．２双向电泳蛋白质样品的制备培养细胞生长至对数生长期后，清洗３次，胰酶消化收集沉淀细胞于１．５ｍｌｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，加入细胞裂解液，反复冻融３个循环，离心３０ｍｉｎ。移取上清液于另一干净ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，测蛋白浓度后保存于－８０℃备用。

１．２．３角质细胞总蛋白的双向电泳第一向固相ｐｈ梯度等电聚焦：取４５０μｇ蛋白质加入水化上样液后均匀加在胶条槽，取出ｉｐｇ胶条缓慢放入槽内，用ｉｐｇｐｈｏｒ等电聚焦仪，如下程序自动进行：①３０ｖ，１０ｈ泡涨；②２００ｖ，１ｈ除盐；③１０００ｖ，２ｈ除盐；④８０００ｖ，２ｈ线性升压；⑤８０００ｖ，１０ｈ等电聚焦。第二向垂直平板ｓｄｓ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｓｄｓ-ｐａｇｅ）：配制１２％ｓｄｓ-ｐａｇｅ均匀胶。将平衡后的ｉｐｇ胶条移至凝胶上方，低熔点琼脂糖封闭。凝固后垂直电泳系统系统进行电泳。电泳参数设置：第一步２．５ｗ／胶，３０ｍｉｎ；第二步１７ｗ／胶，５ｈ，至溴酚蓝前沿达玻璃板底部停止。考马斯亮蓝染色：将２-ｄｅ胶放入固定液中固定后，考马斯亮蓝ｒ-２５０中染色，后脱色至背景清晰。凝胶图像分析：通过ｉｍａｇｅｓｃａｎｎｅｒ扫描仪以及ｌａｂｓｃａｎ扫描软件进行扫描获取图像，利用ｉｍａｇｅｍａｓｔｅｒ２ｄ软件对图像进行强度校正、点检测、匹配、比较差异等分析。

２．１人角质形成细胞体外培养

皮肤标本经过两步消化法制成细胞悬液，细胞呈圆形，均质。２ｄ后细胞由圆形变成扁平形，细胞体积增大，形成的小集落。７～１０ｄ细胞逐渐汇合连接成片，１１～１５ｄ，细胞完全融合，呈铺路石样形态（图１）。

２．２ｄｌｅ皮损和正常皮肤角质细胞双向电泳图谱特征

获得了重复性较好、分辨率较高的ｄｌｅ及正常皮肤角质形成细胞双向电泳图谱。用ｉｍａｇｉｎｇｍａｓｔｅｒ２ｄ５．０分析软件进行点分析，皮损组和对照组在凝胶上的平均蛋白质点数分别为１５６６±３２和１６８２±３８。其中的蛋白多集中于ｐｈ４．５～６．０，分子质量１４～９０ｋｕ区域。皮损组和对照组的平均匹配点数分别为１２８６±１４和１３１４±２１，匹配率分别为８２．１２％和７８．１２％。皮损组和正常组蛋白质点在ｉｅｆ方向的偏差分别为为（０．６８７±０．２４３）ｍｍ和（０．７４３±０．２６８）ｍｍ，在ｓｄｓ-ｐａｇｅ方向上的偏差分别为（０．８９７±０．３１５）ｍｍ和（０．７２５±０．２５４）ｍｍ，具有较好的重复性（图２）。

２．３ｄｌｅ皮损和正常皮肤角质细胞蛋白质组的表达差异

利用ｉｍａｇｉｎｇｍａｓｔｅｒ２ｄ５．０分析软过对图像进行系统分析后，获得差异蛋白质点数为２２个，其中１１个在皮损高表达，２个在皮损组低表达，４个点仅在正常对照组表达，有５个点仅在病例组表达（图３）。ｄｌｅ皮损组缺失或新增的蛋白表达点的具体信息见表１和表２。

ｄｌｅ具体的发病机制仍然不明确，多项研究提示角质形成细胞对疾病的发生发展具有重要影响，参与皮损形成。角质细胞在外界刺激下启动调亡程序，释放核酸片段，胞内抗原转位于膜表面，诱导自身抗体产生，并通过免疫沉积和介导细胞毒作用诱导皮损形成［１－３］。ｋｕｈｎ等［４］研究证实ｄｌｅ皮损内角质细胞表面高表达ｉｃａｍ-１、ｈｌａ-ｄｒ、和ｖｃａｍ-１等黏附分子，促进了炎症细胞的向表皮的迁移，参与皮损形成。此外，角蛋白在ｄｌｅ皮损中呈现典型性改变，ｋ１６和ｋ６表达增强，ｋ１表达减弱［５］。然而，以往研究往往多着眼于一种或几种已知的蛋白，针对了发病环节中局部、个别因素，蛋白质组学则从整体水平探索ｄｌｅ致病相关蛋白。

本实验首次应用双向凝胶电泳技术分离ｄｌｅ患者皮损及正常皮肤角质细胞总蛋白质，获得完整双向凝胶电泳图谱，并采用ｉｍａｇｉｎｇｍａｓｔｅｒ２ｄ图像分析软件进行比较分析。发现有２２个蛋白质点重复出现表达异常，其中１１个在皮损组高表达，２个在皮损组低表达，有５个点仅在病例组表达，４个点仅在正常组表达。我们认为，ｄｌｅ皮损表达增强的蛋白可能是一些高表达的基因产物，诱导皮损形成等有关；而在ｄｌｅ皮损中中比对照组缺少或消失的蛋白质，则可能是一些保护或是某些起调节作用的蛋白质。这些蛋白质一方面可能作为诊断的标记物，另一方面也能有助加深对疾病发病机制的了解，还能帮助我们寻找新的药物作用靶点［６－７］。

据蛋白质斑点的分子质量和等电点以及蛋白质来源等信息，利用蛋白质组搜索引擎ｔａｇｉｄｅｎｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｔａｇｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）对部分差异蛋白质点进行检索，初步判断ｄｌｅ组中明显上调的ｉｄ９９７可能为热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ９０，ｈｓｐ９０）。ｈｓｐ家族被认为是细胞在一些应激条件下高效表达的一族细胞保护蛋白，参与重要的细胞生理活动，如蛋白质转位、拆叠和装配。有研究表明，狼疮患者外周血单个核细胞ｈｓｐ９０表达显著增高，且与病情活动密切相关，可能在发病机制中发挥重要作用［８］。大量文献提示，ｈｓｐ表达与紫外线密切相关，紫外线通过多条信号传导途径调节角质细胞ｈｓｐ基因表达［９］，进而可能诱导和加重ｄｌｅ皮损形成。表１还列出其他表达缺失和新增的蛋白质点，进一步对这些蛋白点进行质谱鉴定和功能性研究，对筛选疾病分子标记和明确发病机制均有着重要的意义。