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作者：张钦，马真胜，刘建，孟国林，张遥钜悖胖久
【摘要】目的:探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞在修复兔颅骨缺损中的应用前景.方法:提取兔脂肪源性干细胞，成骨诱导并检测，将成骨诱导前后的脂肪源性干细胞种植到自制松质骨支架上，将细胞支架复合物和单纯支架材料分别移植至兔颅骨缺损部位.结果:与未诱导的脂肪源性干细胞复合支架、单纯支架以及空白处理对比，成骨诱导后的脂肪源性干细胞复合支架修复骨缺损面积最大，差异具有统计学意义（P<0.05）.结论:脂肪源性干细胞可作为骨组织工程的种子细胞，其成骨诱导后与自制松质骨复合植入体内，能显著促进骨缺损的修复.
【关键词】脂肪源性干细胞；异种松质骨；支架材料；骨代用品；生物医学工程；成骨诱导；种子细胞
如何获得充足的种子细胞是长期以来限制组织工程研究的瓶颈，骨髓基质干细胞尽管已被广泛应用于组织工程研究，但由于其干细胞含量过低、骨髓抽取量有限以及对患者造成的创伤等，使其广泛应用到受限.2001年Zuk等［1］从脂肪组织中成功提取了干细胞，并成功诱导其向骨、软骨、脂肪、心肌等多个方向诱导分化.我们将成骨诱导的脂肪源性干细胞（adiposederivedstemcells，ADSCs）与异种松质骨支架复合，移植至兔颅骨缺损部位，以探讨成骨诱导脂肪源性干细胞修复骨缺损的应用前景.
1材料和方法
1.1材料新西兰大白兔12只，4mo龄，体质量2.0～2.2kg（第四军医大学实验动物中心）；Dolbecco改良的Eagle培养基（DMEM），胎牛血清（FBS），地塞米松，抗坏血酸，β甘油磷酸钠（美国Sigma公司）；碱性磷酸酶（ALP）活性测定试剂盒（南京建成生物技术有限公司），牛股骨，甲醇，氯仿，300g/LH2O2等（市售）.
1.2.1ADSCs的分离培养［1］将新西兰大白兔按0.2mL/kg速眠新麻醉，（本文来自中科软件园www.4oa.com，转载请注明！）取颈部后正中3cm切口，无菌切取肩胛上脂肪组织约2mL.清除切取组织中肉眼可见的小血管，去除外包膜和明显的结缔组织，DHanks冲洗3遍以洗去红细胞的污染.切碎成糊状，加入2g/LⅠ型胶原酶5mL，在37℃水浴搅拌消化40min，过滤，加入两倍体积DMEM培养液（含100mL/LFBS,1×105U/L青霉素,1×105U/L链霉素），1000r/min，离心10min，倾去上层脂肪及上清，基础培养基重悬细胞,接种至25cm2培养瓶内,种植密度1.5×104/cm2.在37℃培养箱内培养,3d后换液，观察原代细胞的生长.细胞融合达90%时用2.5g/L胰蛋白酶消化传代.
1.2.2ADSCs的成骨诱导在第1次换液时将部分细胞改为成骨诱导培养液（基础培养液加10nmol/L地塞米松，10mmol/Lβ甘油磷酸钠，50mg/L抗坏血酸［1］）培养.细胞融合达90%时用2.5g/L胰蛋白酶消化传代.
1.2.3ALP活性测定将第2代ADSCs以5×103/孔的密度接种于96孔板中,成骨诱导培养液诱导0，3，6，9，12，15d后,PBS漂洗,加入50μL细胞裂解液4℃过夜,ALP活性测定试剂盒检测ALP活性.
1.2.4茜素红染色取成骨诱导1wk的细胞爬片培养1wk,PBS冲洗3遍，950mL/L乙醇固定10min，蒸馏水冲洗3次，1g/L茜素红于37℃染色30min，蒸馏水冲洗，干燥，封片.
1.2.5松质骨支架的制备取市售牛股骨，将股骨头松质骨加工成直径10mm，厚2mm的骨片.将骨片置入1∶1的甲醇∶氯仿100mL中脱脂24h，12h换液1次，蒸馏水冲洗.将脱脂后的骨片置入300mL/LH2O2100mL中脱蛋白48h，每12h换液1次.蒸馏水冲洗.将脱脂、脱蛋白后的骨片置入0.6mol/L的HCL中脱钙5min，蒸馏水冲洗.将脱脂、脱蛋白、脱钙后的松质骨片低温晾干，密封包装，Co60灭菌备用.种植细胞前将成品松质骨无菌条件下PBS液中浸泡7d，分别在基础培养液和诱导培养液中浸泡3d.
1.2.6细胞的种植及检测将ADSCs和成骨诱导15d的ADSCs用2.5g/L胰蛋白酶消化，离心，分别用基础培养液和诱导培养液悬浮,调整细胞密度至1×1010/L.将基础培养液和诱导培养液中浸泡的松质骨支架转移至24孔培养板中，分别种植上述细胞悬浮液100μL，置37℃培养箱内6h使细胞贴壁，然后分别加入基础培养液及诱导培养液培养.将复合后培养5d的细胞支架复合物固定，干燥，喷金，扫描电镜观察.复合培养7d后手术植入颅骨缺损部位.
1.2.7动物分组及处理将12只大白兔按0.2mL/kg速眠新麻醉，取双侧颅骨直径10mm钻孔，24孔分为4组，每组6孔.①支架+成骨诱导ADSCs（A组）；②支架+ADSCs（B组）；③单纯支架（C组）；④对照组（D组）.A，B组植入上述成骨诱导和未诱导的脂肪源性干细胞复合异种松质骨支架，所用细胞均为自体细胞；C组植入单纯的松质骨支架，为前述松质骨成品PBS液中浸泡7d，9g/LNaCl溶液中浸泡3d后植入；D组不做处理.术前术后肌注庆大霉素，2万U/kg.术后14wk用过量戊巴比妥钠麻醉处死动物，取材，X线摄片，计算成骨面积，HE染色行组织学分析.
统计学处理：数据以x±s表示,应用SPSS医用统计软件包进行OneWayANOVA检验.P<0.05为差异具有统计学意义.
2.1细胞培养原代脂肪源性干细胞呈梭形，在β甘油磷酸钠，地塞米松，抗坏血酸的诱导下，能向成骨方向分化（图1A）.诱导2wk后茜素红染色阳性，提示有钙结节形成（图1B）.ALP活性检测结果显示，成骨诱导6d后，支架+成骨诱导ADSCs组与对照组间差异具有统计学意义（P<0.05，表1），支架+成骨诱导ADSCs组的ALP活性明显高于单纯支架组.表1不同时期对照组和成骨诱导组碱性磷酸酶含量
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