海南岛斑点热立克次体病的血清学和病原学调查研究
中国人兽共患病杂志1999年第2期第15卷调查与防制
作者：林英姿 孙晓娟 詹志农 李文广 王华民 林碧瑚 刘佩芹
单位：海南医学院微生物学和免疫学教研室（海口 570000）
斑点热群（SFG）立克次体是立克次体属中最复杂的一群，分布在世界各地。1986年日本内田孝宏在四国地区分离出一株日本红斑热立克次体［1］，为SFG的一个新种，而海南岛的自然景观与四国相似，是否也有日本红斑热立克次体感染存在？我们于1990年在海南岛各地医院收集了1030份当地医院诊断为非立克次体病患者血清及37份疑似立克次体感染患者血清，应用微量间接免疫荧光法（mIFA）检测日本红斑热立克次体（R．japonica）和鼠型斑疹伤寒立克次体（R．typhi）抗体［2］。1993年我们又分别从海南岛的东、南、西、北、中部地区收集561份血清，应用mIFA法进行斑点热立克次体（R．sibirica）、恙虫病立克次体（Karp）、斑疹伤寒立克次体（E．株）抗体检测。1993年以来从上述地区共收集30份疑似立克次体病或不明热患者的全血标本，应用mIFA、病原体分离培养、PCR等方法进行血清初步鉴定。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1．1 血清学调查
1．1．1 抗原片 斑点热立克次体（R．sibirica）、恙虫病立克次体（Karp）、斑疹伤寒立克次体（E．株）抗原片，购自中国军事医学科学院微生物学流行病学研究所立克次体室（1993）。日本红斑热立克次体、鼠型斑疹伤寒立克次体抗原片，由日本内田孝宏教授惠赠（1990）。
1．1．2 血清来源 1990年1030份血清标本采自海南岛东部的琼海市、中南部的通什市、东南部的保亭县、西部的昌江县、北部的海口市和中部的琼中县等各地人民医院诊断为非立克次体病的患者血清，1993年561份血清标本采自海南省东（兴隆）、南（三亚）、西（儋县）、北（海口）、中部（琼中）等地区各人民医院诊断为非立克次体病的患者血清。
1．1．3 检测方法 微量免疫荧光检测法（mIFA）
1．2 病原体分离
1．2．1 血液标本 收集自海南省东、南、西、北、中部地区人民医院门诊疑似立克次体病或不名热患者的抗凝血或血块标本30份。
1．2．2 单层细胞 L929细胞或Vero细胞。
1．2．3 培养基 RPMI1640（GIBCO）或MEM（GIBCO，BRL）。
1．2．4 新生牛血清 购自三利生物制品厂。
1．2．5 培养方法 L929或Vero细胞在含10％新生小牛血清的培养基内37℃48～72h培养，长成单层后即可感染立克次体。感染立克次体后改用含2％新生小牛血清的培养基34℃培养，观察细胞病变，培养15天仍未出现病变者，继续盲传，盲传3代未出现病变者为阴性。
1．2．6 病原体初步鉴定 L929或Vero细胞感染后观察细胞变圆、肿胀、成堆、脱落过程。在细胞出现50％细胞病变时取细胞悬液进行鉴定：
1．2．6．1 细胞涂片，Giemsa染色镜检。
1．2．6．2 mIFA鉴定特异性抗体西伯利亚立克次体（R．sibirica）抗体，斑疹伤寒立克次体（R．typhi）抗体，恙虫病立克次体（R．Karp）抗体（美国UTMBWalker实验室惠赠）。
1．2．6．3 立克次体特异性DNA鉴定（PCR）［3］
2 调查结果
2．1 血清学调查结果
2．1．1 海南省人群血清立克次体抗体检测结果（1990） 1030份血清检测结果：大多数血清在1∶20滴度下日本红斑热立克次体IgG抗体mIFA反应阴性，只有2份血清含有高滴度日本红斑热立克次体IgG抗体（≥1∶160）。其中642份收集自海南岛东南部、中南部（五指山周边区）和北部（海口市）地区的人群血清中，日本红斑热立克次体IgG抗体阳性率为2．2％，斑疹伤寒立克次体IgG抗体阳性率为5．1％（见表1）。在斑疹伤寒立克次体IgG抗体阳性血清中40％有斑疹伤寒IgM抗体（滴度≥1∶80）（见表2）。在当地疑似立克次体感染的患者血清中，约半数含有高滴度斑疹伤寒立克次体IgMIgG抗体（滴度均≥1∶160）（见表3）。4例患者双份血清检查，斑疹伤寒立克次体IgMIgG抗体均有4倍以上增长［4］。
表1 海南岛人群立克次体IgG抗体mIFA检测结果（一）
（1990）
血清采集 地区日本红斑热立克次体**斑疹伤寒立克次体*** 标本数阳性数*阳性率％标本数阳性数阳性率％通什市33082．4330133．9保亭县10321．81031211．6海口市20943．920987．8合计 642142．2642335．1*血清稀释度1∶20呈＋＋免疫荧光反应者为阳性
**与斑疹伤寒立克次体有交叉反应的血清不包括在内
***与日本红斑热立克次体有交叉反应的血清包括在内表2斑疹伤寒和日本红斑热IgM抗体mIFA检测 （1990）
血清采集地区斑疹伤寒立克次体抗体 （≥1∶80）日本红斑热立克次体抗体 （≥1∶80）通什市4／130／13保亭县6／120／12合计10／250／25表3疑似立克次体感染患者血清抗体mIFA检测结果
（1990）
血清采集 地区患者数阳性数斑疹伤寒立克次体抗体（滴度≥1∶160）
IgGIgM日本红斑热立克次体抗体（滴度≥1∶160）
IgGIgM通什市1477701保亭县2310101002合计 3717171703**三份血清均与斑疹伤寒立克次体抗体有交叉反应
2．1．2 海南省人群561份血清立克次体抗体检测结果（1993）
2．1．2．1 IgG抗体检测结果：斑点热立克次体IgG抗体阳性率为30．83％，斑疹伤寒立克次体IgG抗体阳性率为18．77％，恙虫病立克次体IgG抗体阳性率为13．55％。斑点热立克次体IgG抗体的分布：东部地区（兴隆）阳性率为27．62％，南部地区（三亚）阳性率为18．56％，西部地区（儋州）阳性率为45．00％，北部地区（海口）阳性率为19．15％，中部地区（琼中）阳性率为39．41％。经统计学分析，各地区抗体阳性率有明显差异，中部和西部明显高于南部和北部（见表4）。
表4海南岛人群立克次体IgG抗体检测结果（二）
（1993）
地区恙虫病斑疹伤寒斑点热斑点 性％标本 数阳性 数阳性 率％标本 数阳性 数阳性 率％标本 数阳性 数阳性 率％兴隆农场115108．691052624．761052927．6211．43（east）三亚市9777．229711．03971818．560（southen）儋州市1113228．831003535．001004545．0015．00（west）海口市1021211．761001313．00941819．151．06（northern）琼中市1361511．031362619．121365439．7111．08（centre）合计5617613．5553810118．7753216430．838．08*血清稀释度1∶20呈＋＋免疫荧光反应者为阳性。
显著性差异测定：X2＝33．77，P＜0．005．
2．1．2．2 斑点热和斑疹伤寒立克次体IgM抗体检测结果：斑点热IgM抗体滴度≥1∶80者46．30％（25／54），斑疹伤寒IgM抗体滴度≥1∶80者32．07％（17／53）（见表5）。
表5斑疹伤寒和斑点热立克次体IgM抗体mIFA检测
（1993年）
地区斑疹伤寒（E．strain）斑点热（R．sibirica）检测数*阳性数**阳性率％检测数阳性数阳性率％兴隆农场16531．2515960．00（east）三亚市000000（southen）儋州市23730．43251040（west）海口市200000（northern）琼中市12541．6714642．86（centre）合计531732．07542546．30*检测标本IgG抗体滴度≥1∶20
**血清稀释度≥1∶80呈＋＋免疫荧光反应者为阳性2．2 病原体分离结果
2．2．1 20份抗凝血标本用L929单层细胞培养法共分离出12株立克次体，经mIFA和PCR鉴定结果：斑点热立克次体7株，斑疹伤寒立克次体株2株，恙虫病立克次体3株（1993）。
2．2． 10份血块标本用Vero单层细胞培养法共分离出7株立克次体，经mIFA和PCR鉴定结果：斑点热立克次体4株，斑疹伤寒立克次体2株，恙虫病立克次体1株（1997）。
3 讨论
3．1 本调查结果表明，海南岛有多种立克次体病（恙虫病、斑疹伤寒、斑点热）存在，其地理分布较广，主要在山区和丘陵地带（琼中县大丰农场、儋州市、通什市、保亭县等五指山周边区），平原和滨海城市（海口市、三亚市）较少。海南岛是否有日本红斑热立克次体存在尚未明确，从本调查结果看来，即使有也是罕见的。
3．2 本调查首次发现海南岛有斑点热感染存在。修正了过去认为我国南方没有斑点热的观点。其病原体的种别尚待进一步鉴定。
2．1．2．2 斑点热和斑疹伤寒立克次体IgM抗体检测结果：斑点热IgM抗体滴度≥1∶80者46．30％（25／54），斑疹伤寒IgM抗体滴度≥1∶80者32．07％（17／53）（见表5）。
3．3 本调查首次应用L929细胞和Vero细胞培养法直接从病人血液分离出恙虫病、斑疹伤寒和斑点热群立克次体。细胞培养法较传统的动物接种法、鸡胚培养法试验条件稳定，方法简便。有条件进行细胞培养的单位均可开展
4 参考文献
1．UchidaTYu，etal．IdentificationofauniquespottedfevergrouprickettsiafromhumansinJapan．JInfectDis，1989，159：1122．
2．FengHueimin，etal．SerologicSurveyofSpottedfevergroupRickettsiosisonhainanIslandofChina．MicrobiolImmunol，1991，35（9）：687．
3．詹志农等．应用PCR技术检测斑点热群立克次体特异性DNA（待发表）．
4．林碧瑚等．海南岛斑点热和斑疹伤寒立克次体抗体检测报告．中国人兽共患病杂志，1992，8（1）：41．
1998年11月3日收稿
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