家兔急性肾小管坏死实验

家兔急性肾小管坏死实验

【目的要求】1．复制急性中毒性肾功能衰竭的动物模型2．观察升汞中毒家兔的一般状态，尿液的变化，测定酚红及血清尿素氮、血清钾水平以了解肾功能情况，并观察肾脏的形态改变。3．加深理解急性肾衰的病因、发病机制和机能代谢变化。【实验原理】采用重金属类肾毒物HgCl2，造成家兔急性肾小管坏死。【实验动物】家兔，体重?1.5～2.0kg。【药品与器材】1%HgCl2溶液，生理盐水，0.6%酚红溶液，50%葡萄糖液，尿素氮标准应用液Ⅰ（1ml=0.025mg氮），二乙酰-肟-硫氨脲（DAM-TSC）液，酸混合液，5%醋酸溶液，尿素氮标准应用液Ⅱ（1ml=0.005mg氮）。兔手术台，i-STAT血气分析仪、721型分光光度计，ATC-1E型屈折度计（尿比重检测计），离心机，显微镜，水浴锅，电子称、手术器械一套，动脉插管1根，输尿管塑料插管，50ml、200ml、1000ml微量移液器，注射器，5ml刻度吸管，洗耳球，滴管，玻片，玻璃试管，试管夹，试管架，酒精灯。【实验步骤】1．家兔急性中毒性的制备实验分为两组家兔，一组为正常对照组，一组为肾中毒实验组。于实验前一天，家兔称重后，按剂量1.2ml/Kg，皮下或肌肉注射一次氯化高汞（HgCl2），造成急性中毒性肾小管坏死病理模型。对照组家兔则在相同部位注射同量的生理盐水。注意：（1）此步骤由实验技术人员在实验课前一天完成操作，但同学须掌握造病方法。（2）实验课时，学生各分组中，有一组用对照组动物进行实验，其结果应提供其它小组使用来进行对照分析；对照组的分组学生也可使其它任何一组的造病动物来源的实验资料，进行分析。（3）实验动物耳部记录有该动物的体重，各组可用以作记录体重的依据。2．颈动脉插管术与血样本的制备（1）取正常或中毒家兔在记录体重后，固定于兔手术台；（2）颈部去毛，手术部位局麻；（3）在甲状软骨水平下作颈部正中切口，长约4cm，正对气管软骨环，逐层钝性分离，暴露喉结以下气管软骨环后，再向两侧分离，并在胸锁乳突肌内侧下方分离出一侧颈总动脉，长度约2.5～3cm（具体操作过程，可见P49）。（4）动脉插管前，远心端必须先结扎，用动脉夹夹住近心端。（5）然后用眼科剪刀剪开动脉壁的三分之一大小，注意遮掩，小心出现喷血。（6）插入前端已剪成斜口的导管，结扎插入导管部的血管，使导管被固定。（7）血气分析打开颈总动脉的动脉夹，弃去最先流出的2、3滴血液后，然后立即将插管口直接对准电极板芯片的注血口，注入全血到标准刻度，盖上小盖，插入i-STAT血气分析仪，进行血气分析。（8）再经动脉插管取正常或中毒家兔血2~3ml，待凝固15～20min后，离心3000rpm，5～10min，分离血清。用滴管将血清吸出，分别移入干燥的小试管中备用。所制备的血清用来测定血清尿素氮和血清钾，方法见附录部分的介绍。3．首次取尿液样品和输尿管插管术（1）下腹部剪毛，局部麻*醉，在耻骨联合上1.5cm处作正中切口，长约4cm。分离皮下组织，沿腹白线切开腹膜，暴露出膀胱。用注射器吸出膀胱内全部尿液置于试管（10ml的尖底离心管）中备用。此尿液样用来测定尿比重、尿蛋白定性和尿沉渣镜检，方法见附录部分的介绍。（2）输尿管插管术：将膀胱向前下方翻向体外，在膀胱底部找到并分离一侧输尿管，在输尿管靠近膀胱处用线结扎，略等片刻，待输尿管略充盈后，用眼科剪剪一小口，向肾脏方向插入一根细塑料管，结扎固定插管，以备收集尿液。如果插管失败，可改为在实验末收集膀胱内尿液，作测定用（具体操作过程，可见P50）。4．酚红排泄试验从兔耳缘静脉准确快速注入0.6%酚红溶液（1ml/只），并开始计时，然后从耳缘静脉缓慢输注50%葡萄糖液20ml，使引起利尿作用。此后收集60min尿液，进行PSP测定，方法见附录部分的介绍。注意：如因总实验时间的限制，可以统一用收集30min的尿液，估计实验动物酚红排泄的情况。5．肾脏的形态观察实验结束后，用经耳缘静脉注射5~10ml空气的方法，将对照和实验性肾功能衰竭家兔处死，取出肾脏，称肾脏的重量，测定肾与体重的比值（肾体比，体重指去肠道后的体重）。观察肾中毒家兔肾脏的体积大小，表面色泽；在矢状方向横剖切开肾为两半后，观察皮质条纹及色泽；在再度合拢两半肾后，观察切口能否完全对合。以病肾与正常肾脏作比较。【附录】1．血清尿素氮测定（1）原理：血液和尿中的尿素在强酸条件下与二乙酰-肟（Diacetylmonoxim）和硫氨尿（Thio-Semicarbazixe）共煮，生成红色复合物。颜色深浅与尿素氮含量成正比关系。（2）操作方法按表所示，分别在空白管、标准管、测定管A和测定管B按顺序加入各种试剂，混匀，然后置沸水锅中准确计时煮沸10min，置流水中冷3min后比色，用520nm波长比色，以空白管调零。

标准应用液II

注：测定管A为正常家兔的血清，测定管B为肾中毒的家兔血清（3）血清尿素氮测定的计算方法测定管光密度（Du）/标准管光密度（Ds）*0.002*（100/0.02）=Du/Ds*10=血清尿素氮（mg%）

2．尿比重测定用吸管取尿液滴加于ATC-1E型屈折度计（尿比重检测计）的检测面上，盖上盖后，通过接目镜观察尿比重数值，记录尿比重读数。3．尿蛋白定性检查取正常或肾中毒家兔的尿液各约2～3ml，分别放入试管中，以试管夹夹住试管，在酒精灯上加热至沸腾（注意试管口不要对着人，小心加热，切勿让试管内尿液溢出）。若有混浊，加入5%醋酸3~5滴，再煮沸。若尿变清，说明原先出现的混浊是因尿内无机盐引起；加酸后若混浊加重，则表示尿中含有蛋白质，根据尿液混浊程度可估计尿蛋白量的多少。“-”尿液清晰，不显混浊，无明显蛋白尿。“+”尿液出现轻度、白色的混浊（含蛋白质0.01~0.05g%）。“++”尿液呈稀薄乳样混浊（含蛋白质0.05~0.2g%）。“+++”尿液乳浊，或有少量絮片存在（含蛋白质0.2~0.5g%）。“++++”尿液出现絮状混浊（含蛋白质>0.5g%）。4．尿液镜检（1）将收集的尿液取出一滴置于玻片中，与显微镜下，细胞计数至少检查10个高倍视野；管型计数至少检查10个低倍视野，用最低至最高数报告。如WBC2~6/HP；管型0~3/LP。（2）亦可取一定量的尿液分别置于两支离心管中，离心沉淀600rpm?5min，取尿沉渣涂片，先低倍后高倍镜观察，计数10个不同视野的管型和细胞的近似平均值，其中管型以低倍视野计数。5．PSP试验将60min（或30min）内收集的全部尿液（包括可能在膀胱中最后抽取的尿液），全量置于500ml量筒（或刻度烧杯）内，加入10%氢氧化钠5ml，并加水至500ml，搅拌均匀后从中取出10ml溶液置于试管中，与一系列不同酚红浓度的标准管比较，判定由尿排出的酚红的百份比。按下表配制的酚红标准液，可计算出一小时内排出酚红的百分率（近似值）。【试剂的配制方法】1．血清尿素氮测定用试剂（1）二乙酰-肟-硫氨尿液称取二乙酰600mg，硫氨尿30mg，蒸馏水溶解并加至100ml。（2）酸混合液浓磷酸（85-87%）35ml，浓硫酸80ml，慢慢滴加于800ml水中，冷却后加水至1000ml。（3）尿素氮标准液的制备①储存液（1mg氮/ml）称取分析纯尿素2.143g，加0.01N硫酸溶解，并加至1000ml，置冰箱内保存。②尿素氮标准应用液Ⅰ（0.025mg氮/ml）吸取尿素氮标准储存液2.5ml，加0.01N硫酸至100ml。③尿素氮标准应用液Ⅱ（0.025mg氮/ml）吸取尿素氮标准应用液Ⅰ20ml，加0.01N硫酸至100ml。2．酚红标准液的配制（如下表）表2-6-2各种浓度酚红标准液的配制

100%酚红（ml）

0.05%氢氧化钠（ml）

标准浓度值（%）

【注意事项】1．血清、标准液等试剂量应准确。2．加入标准应用液Ⅱ之后，应不超过1~2min，立即放入沸水中进行后面的操作。3．煮沸及冷却时间应准确，否则颜色反应消退。4．正常家兔血清尿素氮14~20mg%，急性升汞中毒性肾病家兔血清尿素氮约为正常值的1~2倍。【思考题】1．根据实验结果，分析升汞引起急性肾功能衰竭的机制。2．依据血气分析结果，讨论引起机能代谢发生了哪些变化？为什么？3.结合本实验结果，分析产生尿蛋白、管型的机理。4.引起急性肾功能衰竭发生的常见原因有哪些？如何分类？5.急性肾功能衰竭病人进入多尿期，尽管尿量已有明显增多，但可存在氮质血症，其原因是为什么？

【实验结果记录】