反义Smad4基因转染对抗昆明小鼠肝脏纤维化发展的效果观察

反义Smad4基因转染对抗昆明小鼠肝脏纤维化发展的效果观察hc360慧聪网医疗器械行业频道2004-04-2110:20:08
[摘要]目的探讨反义Smad4基因阻断TGF-β信号传导系统对抗小鼠肝脏纤维化的效果。方法将反义Smad4基因导入CCl4／乙醇诱导的昆明小鼠纤维化肝脏，用Southernblot检测整合情况，用Northernblot、RT-PCR及Westernblot方法观察Smad4的表达，比较各组小鼠肝脏纤维化程度。结果反义Smad4基因可整合到病毒处理组小鼠肝脏。纤维化肝脏Smad4表达较正常组明显增强。经转基因处理后，小鼠纤维化肝脏Smad4的表达明显弱于对照组，肝脏纤维间隔不同程度地减少、变窄或不完整，纤维化程度也有所减轻。结论反义Smad4基因能有效减少Smad4基因的表达，进而部分阻断TGF-β信号传导系统，以阻止贮脂细胞的活化，减少细胞外基质的产生，从而减缓肝纤维化
[关键词]肝硬化；转化生长因子β；Smad4；反义基因
TGF-β1的信号传导需要Smad蛋白分子参与（Smad2、Smad3和Smad4），其中Smad4是最关键和必不可少的蛋白分子[1]。为阻断TCP-β1的信号传导，我们构建了含有反义SInad4基因的逆转录病毒表达载体，并导人小鼠纤维化肝脏内，观察其抑制Smad4表达及胶原合成的效应，现将结果报告如下。
一、材料
材料与方法
健康雄性昆明小鼠65只，体重22-26g。反义Smad4逆转录病毒载体RTATSmad4由本室构建：含Smad4的质粒pSmad4由美国NIU的MarkP.deCaestecker教授惠赠，该质粒含有鼠Smad4cDNA的1248bp长的片段，经测序正确，逆转录病毒载体pLXSN和PA317包装细胞由梁志清博士惠赠。所重组的病毒滴度为2.32×105pfu／ml。地高辛标记及检测试剂盒（Roche），脂质体转染试剂盒（LipofectAMINE）（Promage），化学发光试剂盒、Smad4抗体和Ⅰ型胶原抗体均购自SantaCruz公司。
二、方法
1．动物模型：将小鼠随机分成3组：肝硬化组
（LC组）20只；反义Smnad4基因治疗组（ATLC组）35只；正常组（LN组）10只。用CCl4／乙醇诱导小鼠肝硬化模型，方法如下：LC和ATLC组均自由饮用8％乙醇水溶液，进食颗粒饲料，每周2次皮下注射25％CCl4橄榄油溶液5μl／g，持续20周。LN组饮用灭菌自来水，自由进食颗粒饲料。
2．动物处理：将诱导前l周的ATLC组小鼠麻醉后开腹，从肠系膜上静脉注入300μl含有反义Smad4基因的逆转录病毒载体RTATSmad4，于诱导2、4、8周后分别重复经尾静脉注射1次，量同前。LC组同时注射300μl生理盐水。LN组不作处理。20周后处死各组动物，待检测用。
3．指标测定：采用反向插入逆转录病毒载体中的1.2kb的Smad4片段作探针行SouthernBlot，采用722kb的Smad4cDNA探针行NorthemBlot。RT-PCR检测Smad4、TGF-β1、TBRⅠ、ColⅠ、TIMP1，MMP2的表达，GAPDH为看家基因，各基因引物序列。WesternBlot检测Smad4表达，免疫组织化学检测Ⅰ型胶原表达。
结果
1．一般状况及大体观察：正常组一般状况良好，无死亡。硬化组一般状况较差，20只中死亡12只。治疗组一般状况稍差，35只中死亡19只。两组死亡率比较，差异无显著性。死亡原因主要是肝坏死及腹腔、肺部感染。硬化组小鼠肝脏布满均匀细结节，而治疗组细结节较少且不均一。
2．病理学改变：根据HE染色结果确定肝组织纤维化程度和积分[2]：“-”肝组织中无纤维增生，0分；“±”仅汇管区少量纤维增生，0.5分；“+”汇管区纤维向小叶内伸人，尚未进入小叶1／2，1分：“++”纤维向小叶内进一步伸入，但尚未达中央静脉，2分；“+++”纤维向小叶内伸人达中央静脉，但尚未形成假小叶，3分；“++++”肝组织正常结构破坏，纤维弥漫增生，分割成假小叶，4分。计算每组积分总和、均数和标准差。治疗组与硬化组的肝纤维化程度比较差异有显著性（X2=9.134>X2（3,0.05）=7.815，P<0.05）。两组积分均数比较，差异有显著性（t=4.461，P<0.01）。
3．SouthernBlot检测：反义基因已经整合进治疗组小鼠的肝脏细胞基因组。NorthernBlot显示硬化组小鼠肝脏Smad4mRNA表达高于正常组，治疗组Smad4mRNA的表达与硬化组相比明显下调；与RT-PCR的结果相同。WesternBlot显示硬化组小鼠肝脏Smad4蛋白表达高于正常组，治疗组小鼠肝脏Smad4蛋白表达与硬化组相比明显下调。RT-PCR显示治疗组小鼠肝脏的TGF-β1、Ⅰ型胶原（ColⅠ）和基质金属蛋白酶抑制因子Ⅰ（TIMP1）的mRNA表达均低于硬化组，但两组tβRⅠ、MMP2的表达差异无显著性。免疫组化显示肝脏Ⅰ型胶原（ColⅠ）蛋白表达随着纤维化程度的加重而明显增强，治疗后绝大部分小鼠肝纤维化程度减轻，Ⅰ型胶原的蛋白表达也明显下调。
讨论
TGF-β1在肝纤维化中起重要作用[1]，因此，抑制TGF-β1的活性，可以阻止肝纤维化的进程。纤维化肝脏内Smad2，Smad3、Smad4及TGF-β1的表达均明显高于正常肝脏[3，4]，本实验也显示，硬化组小鼠肝脏内的Smad4表达显著高于正常组。说明在肝硬化发展进程中，TGF-β-Smad这一信号传导系统充分增强。
我们通过逆转录病毒载体将反义Smad4基因导入小鼠肝脏，使其阻止肝脏Smad4的表达。通过Southern、Northern、Western、RT-PCR发现反义Smad4已经整合人治疗组小鼠肝脏且下调Smad4的表达，减少肝脏胶原产生，减轻肝纤维化程度。RT-PCR显示反义Smad4还能下调肝脏TGF-β1、ColⅠ和TIMPⅠ的mRNA表达，但对TpRⅠ、MMP2的表达无明显影响。免疫组化表明反义Smad4能减少治疗组肝脏的I型胶原合成。
治疗组中也有2只小鼠肝纤维化程度达到了“++++”，治疗无明显效果，但是检测其肝脏内仍有反义Smad4基因整合；其他14只治疗组小鼠也有不同程度的肝纤维化，这与以下因素有关：小鼠之间存在个体差异；逆转录病毒转染效率仍不够高；单一反义Smad4基因治疗肝纤维化的效果有其局限性，因为肝纤维化毕竟是多因素所造成的，治疗上也应该采用综合治疗。
本研究结果显示，反义Smad4基因既能阻止肝脏内源性Smad4的合成，还能阻止或减少肝脏细胞外基质的合成，从而减缓或阻止肝纤维化的进程，这种作用主要是通过消弱或阻断TGF-β1的信号传导而实现的，有潜在的临床应用价值。hc360慧聪网医疗器械行业频道慧聪医疗器械医疗器械医疗设备CTB超信息来源：徐新保冷希圣杨晓