小儿隐孢子虫病的实验诊断研究
中华儿科杂志2000年第6期第38卷论著
作者：郑成中 李为明 崔凤文 崔守信 杨颍
单位：郑成中（100101 北京，解放军第三○六医院儿科）；李为明（第三军医大学新桥医院儿科）；崔凤文（第三军医大学新桥医院儿科）；崔守信（第三军医大学新桥医院儿科）；杨颍（第三军医大学新桥医院儿科）
关键词：隐孢子虫病；儿童；荧光免疫测定；抗体，单克隆
【摘要】 目的 探讨不同检测方法对小儿腹泻粪便中隐孢子虫卵囊（CSO）的诊断效果。方法对649例急性腹泻患儿的粪便采用7种方法检测CSO：（1）番红-美兰染色法（SMB）；（2）改良抗酸染色法（MAF）；（3）蔗糖漂浮（SSF）后SMB染色法；（4）PBS-乙醚（PBS-E）离心沉淀后MAF染色法；（5）聚蔗糖-泛影酸钠（FSD）纯化后扫描电镜法（SEM）；（6）FSD或Percoll纯化后免疫组化法（ABC）；（7）Percoll纯化后间接免疫荧光法（IFA）。对649例患儿的新鲜粪便标本同时采用前4种方法检测，而对患儿的经预处理低温存放的710份标本（已知阳性86份，已知阴性624份）同时采用7种方法检测。结果 共检出隐孢子虫腹泻病26例，阳检率4.0%。SMB和MAF（SMB+MAF）方法的敏感性、特异性分别为80.2%和94.1%、61.6%和98.4%（P＜0.01），它们的检测准确性分别为92.4%和93.9%（P＞0.05）,SSF+SMB、PBS-E法+MAF法及ABC法的敏感性、特异性、准确性均为100%，与SMB、MAF法相比较均有非常显著性意义（P＜0.01）。结论 粪便直接涂片SMB法阳检率高，假阳性也高，适宜筛查；MAF法与之相反，漏诊率高；ABC法与金标准IFA法检测效果与IFA法一样，但方法繁琐造价高；SSF或PBS-E法浓集CSO后SMB、MAF法的检测效果与IFA法相似，且经济、简便，是检测粪便中CSO较理想的方法。
Laboratorystudyondiagnosisofcryptosporidiosisinchildrenwithdiarrhea
ZHENGChengzhong*,LIWeiming,CUIFengwen,etal.
* DepartmentofPediatrics,No.306HospitalofPLA,Beijing100101，China
【Abstract】 Objective Toevaluatethediagosticeffects,sensitivity,specificityandaccuracyof7differentmethodsindetectingcryptosporidiumoocysts（CSO）infecalspecimensofchildrenwithdiarrhea.MethodsSevenmicroscopy-basedCSOdetectionmethodswereappliedtounconcentratedandconcentratedfecalsmearsfrom649childrenwithacutediarrhea.Thesevenmethodswereasfollows:（1）Adirecthotsafranin-methyleneblue（SMB）stainmethod,（2）adirectmodifiedacid-fast（MAF）stainmethod,（3）amodifiedSheather′ssucroseflotation（SSF）plusSMBstainmethod,（4）aPBS-etherconcentration（PBS-E）plusMAFstain,（5）acombinationofFicoll-sodiumdiatrizoate（FSD）discontinuousdensitygradientandobservationunderscanningelectronmicroscope（SEM）,（6）FSDorPercollpurifyingCSOmethodplusanavidin-biotin-peroxidasecomplex（ABC）technique,and（7）amonoclonalantibody-basedindirectimmunofluorescenceassay（IFA）.Thefirst4methodslistedaboveweresimultaneouslyusedtoexamineCSOinfreshstoolsamplesfrom649childrenwithdiarrhea.Allsevenmethodswereusedin710previouslycollected,pretreated,stored（at2-8℃）specimens（86knownpositives,624knownnegatives）from649childrenwithdiarrhea.Results Atotalof649diarrheacaseswereexaminedforfecalCSO,whichwereidentifiedin26cases（4.0%）.Thesensitivity,specificityandaccuracyoftheSMBstainandtheMAF（orSMB+MAF）methodforthefecalCSOwere80.2%and94.1%,61.6%and98.4%（P＜0.01）,92.4%and93.9%（P＞0.05）,respectively.Thesensitivity,specificityandaccuracyoftheSSF+SMB,PBS-E+MAF,ABCmethodswereall100%,whichwerestatisticallysignificant（P＜0.01forall）ascomparedtothoseofSMB,MAForSMB+MAFmethods.Conclusions ThedirectSMBstainingoftheunconcentratedfecalsmearsshowedahigherpositiveratethantheoneofthedirectMAFstain,butitsmis-diagnosisratewashigheraswell.Thistestmaybesuitableforscreening.TheMAFstainhadahighfalse-negativerate.ThedetectiveeffectofABCwasthesameasIFAwithmonoclonalantibodies,buttheperformingprocesswascomplicated,manifoldandthereagentsareexpensive.ThediagnosticeffectsofSSF+SMBandPBS-EplusMAFmethodsweresimilar,100%insensitivity,specificityoraccuracy,tooneofthegoldstandardmethods-IFA.Thesetwomethodswereeasyinvisualrecognition,inexpensive,simpleandconvenient,thereforemightbetheidealmethodsforthedetectionoffecalCSO.
【Keywords】 Cryptosporidiosis; Child; Fluoroimmunoassay; Antibodies,monoclonal
1976年，Nime等［1］首次报道了人隐孢子虫性腹泻病（CSS），目前普遍认为是一种世界范围的人兽共患疾病，小儿发病率较高，80年代以后相继创建了不少从粪便中检测隐孢子虫卵囊（CSO）技术［2，3］，但这些方法的敏感性、特异性和准确性尚待进一步研究。本研究着重对前人介绍的及我们改良组建的粪便检查技术进行评估，以期寻找经济简便、敏感性高、特异性强、适宜推广的诊断方法。
对象与方法
一、研究对象
选择以腹泻为主诉，1989年5月～1990年7月初次到第三军医大学新桥医院儿科就诊或住院的12岁以下小儿为筛查对象，共检测649例。
二、粪便标本预处理及保存
所有新鲜粪便标本经浓集纯化或检测后，分别以10%甲醛和2.5%重铬酸钾预处理，2～8℃下保存待进一步检测。
三、诊断标准
1.具有腹泻临床表现。
2.粪便经常规检查、细菌培养（用SS及麦康凯培养基）及轮状病毒检测（ELISA法），除外其它感染性及食饵性腹泻病。
3.粪便检查CSO阳性，全玻片发现一个以上典型CSO者为阳性，基于抗CSO壁单克隆抗体的间接免疫荧光法（IFA）（美国MeridianDiagnostics公司）按试剂提供的阳性、阴性对照试剂判断（此法为诊断金标准）。
四、实验方法
1.直接粪涂片番红-美兰染色法（SMB）及甲醛沉淀后改良抗酸染色法（MAF）筛查。参照Baxby等［4］的SMB法及Garcia等［5］介绍的MAF法染色，加以改良，两法同时对腹泻患儿筛查。新鲜粪便涂片光镜下观察，SMB法使CSO染成明亮的橙红色，呈球形或卵圆形，直径4～6μm,甲醛沉淀后MAF法染色CSO为红色，CSO浓度较低。
2.蔗糖漂浮法（SSF）浓集CSO+SMB染色法检查：在Current等［6］的技术基础上设计SSF法，将2.5%重铬酸钾保存的粪标本经两层纱布过滤，取15ml加入盛有40ml饱和蔗糖液的塑胶瓶内，混匀，650×g离心10min，取表层液以PBS（pH值7.2）离心清洗3次，然后行SMB法染色镜检。SSF法浓集可提高CSO浓度15～40倍，大部分粪渣、真菌、白细胞被去除，浓集后标本经SMB染色法，CSO具有典型的染色特征，每个高倍视野下可见数个至数十个CSO，很容易识别。
3.PBS-E离心沉淀法浓集CSO加MAF染色检查：取过滤后的CSO悬液3ml，加PBS6ml、乙醚1～2ml，混匀，静置3～5min,500×g离心5min，去除上三层（乙醚、粪渣固体栓、PBS层）,沉淀部分以PBS清洗3次，然后进行MAF染色镜检或4℃存放待进一步纯化处理。PBS-E浓集效果与SSF法相当。
4.聚蔗糖-泛影酸钠密度梯度离心法（FSD）纯化CSO后行扫描电镜（SEM）观察:PBS-E初步浓集后，参照Lumb等［7］的FSD法进一步纯化，取纯化后的CSO悬液制备SEM标本，使用Amray-1000B型扫描电镜观察，测微器直接测CSO大小（μm）。FSD法使CSO集中在0.5%聚蔗糖表层条带内，可提高CSO浓度50倍以上,SEM观察CSO形态完整，呈球形或椭球形，测微器测量CSO直径4.1～6.7μm,偶见脱囊现象（子孢子从囊内脱出）。
5.亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术（ABC）检测CSO：FSD或Percoll密度梯度离心法提纯CSO后进行免疫组化染色。以抗CSO壁单克隆抗体（meridianDiagnosticsInc.）为第一抗体，生物素标记的抗鼠抗体为第二抗体，VectastainABC复合液为第三抗体，二氨基联苯胺（DAB）显色，光镜下观察。ABC法使CSO染成棕红色或古铜色，周边着色浓，中心淡，内部隐约可见新月状结构（SZ），无形态、大小、着色与CSO相似的颗粒样结构，使结果更易判断。
6.间接免疫荧光法（IFA）鉴定CSO:用Percoll密度梯度离心法纯化后，CSO集中在第2、3条带内［8］。取10μl加在标有“病人”字样的玻片孔内，加抗隐孢子虫卵囊壁单克隆抗体50μl，室温下湿盒内孵育30min，置入PBS液（0.01mol,pH7.6）内浸洗5min;再加荧光抗体，孵育、浸洗、封片，每批同时做阴性、阳性对照各一孔。用荧光显微镜检测CSO。处理后标本更纯净、CSO浓度更高（100倍以上）。IFA检查CSO呈现黄绿色荧光，直径2～6μm，每高倍显微镜视野见20～100个CSO,单克隆抗体与其它寄生虫卵、细菌无交叉反应，这些病原体不出现特异性荧光。
五、实验分组
1.对649例腹泻患儿随机采集的新鲜粪便标本同时运用4种方法检测，即：直接SMB法、直接MAF法、SSF+SMB法、PBS-E+MAF法检测，任一种阳性者，以SEM法、IFA法鉴定确认。
2.取经预处理低温保存的649例患儿的陈旧标本710份，同时采用上述7种方法检测。
六、统计学处理
对各种检测方法的敏感性、特异性、准确性，采用专用公式进行u检验［9］（u=1p1-p21/S（p1-p2）。
一、临床资料及一般检测结果
对649例急性腹泻患儿的新鲜粪便标本逐一进行4种方法同时检测，直接SMB、直接MAF、SSF+SMB、PBS-E+MAF法的阳检率分别为7.1%、4.6%、4.0%和4.0%，经SEM、IFA法鉴定，共确诊CSS26例，占小儿腹泻中的4.0%（26/649）。CSS患儿年龄3个月～8岁（平均3岁），婴幼儿占58％（15/26），6、7、8月份检出18例（69％）。所有隐孢子虫病患儿未发现明显免疫功能缺陷及营养不良，粪培养及轮状病毒检测均为阴性。
二、7种方法检测CSO的敏感性、特异性和准确性的结果
同时采用SMB、MAF、ABC、IFA法检测62份标本（其中已知阳性标本11份，另随机采集新标本51份，表1），结果提示：SMB和MAF法的敏感性、特异性、准确性分别为93.3%和73.3%,89.4%和97.9%,90.3%和91.9%，ABC法均为100%。
取预处理后低温存储的陈旧粪便标本710份（含26例CSS的已知阳性粪便86份，已知阴性624份）采用7种方法单盲法批量检测。结果表明（表2）：SMB法（69/86）比MAF法阳性率高，假阳性率也较高（37/624）。ABC法、SSF+SMB或PBS-E浓集后MAF染色的86份已知阳性标本均呈阳性结果，无假阳性或假阴性。
表1 62份粪便标本4种检测方法的敏感性和
特异性比较（%）
方法阳性数假阳性数假阴数性敏感性特异性准确性SMB145193.389.490.3MAF111473.397.991.9ABC1500100.0100.0100.0IFA1500100.0100.0100.0 注：其中已知阳性标本11份，随机采集新标本51份,新检出阳性标本4份；SMB：直接粪涂片番红-美兰染色法，MAF：及甲醛沉淀后改良抗酸染色法，ABC：亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术，IFA：间接免疫荧光法，下同三、各种方法的敏感性、特异性、准确性的统计学处理结果
SMB法与MAF法、SMB+MAF法、SSF+SMB法、PBS-E+MAF法及ABC法，除前两者的准确性差异无显著性（P＞0.05）外，其余两种方法的敏感性、特异性及准确性相比差异均有显著性（P＜0.01）。MAF法与ABC法、SSF+SMB法及PBS-E+MAF法的敏感性、特异性及准确性相比差异均有显著性（P＜0.01）,表3。
一、小儿CSS的发病情况及特点
隐孢子虫感染在不发达地区很常见，占小儿腹泻的3%～13%［2，3，10］，本组报告26例，占小儿腹泻的4.0%，比南京报道［11］的（1%）阳性率高。夏季高发，这可能与：地区流行差异，检测CSO的方法不同，敏感性不同或重庆温暖潮湿气候特点有关。婴幼儿易感且症状明显。病程1～3周，腹泻停止后持续排CSO2～4周。
二、直接SMB与MAF染色评估
表2 710份粪便标本7种检测方法结果比较
方法标本数真阳性数假阳性数假阴性数敏感性（%）特异性（%）准确性（%）+PV（%）-PV（%）SMB71069371780.294.192.465.197.2MAF71053103361.698.493.988.994.4SMB+MAF71053103361.698.493.988.994.4SSF+SMB7108600100.0100.0100.0100.0100.0PBS-E+MAF7108600100.0100.0100.0100.0100.0FSD+ABC7108600100.0100.0100.0100.0100.0IFA7108600100.0100.0100.0100.0100.0 注：其中已知阳性标本86份，已知阴性标本624份;+PV:阳性预告值，-PV:阴性预告值，SSF：蔗糖漂浮法，PBS-E：离心沉淀法，FSD：密度梯度离心法，下同表3 各种检测方法敏感性、特异性、准确性统计学分析
方法比较敏感性特异性准确性比较u值P值u值P值u值P值SMB与MAF2.66＜0.013.80＜0.010.93＞0.05SMB与SMB+MAF2.66＜0.013.80＜0.010.93＞0.05SMB与SSF+SMB4.35＜0.016.14＜0.018.25＜0.01SMB与PBS-E+MAF4.35＜0.016.14＜0.018.25＜0.01SMB与ABC4.35＜0.016.14＜0.018.25＜0.01MAF与ABC6.39＜0.013.57＜0.018.09＜0.01MAF与SSF+SMB6.39＜0.013.57＜0.018.09＜0.01MAF与PBS-E+MAF6.39＜0.013.57＜0.018.09＜0.01直接粪涂片SMB染色法敏感性较高（阳检率高），特异性差（阳性结果的验后概率仅为65.1%），适用于筛查患儿，MAF法与之相反，漏诊率高，但综合考虑敏感性和特异性时，二者的诊断准确性比较差异无显著性（P＞0.05）,两法结合可取长补短，可用于初诊患儿。
三、SSF、PBS-E集卵SMB、MAF染色评价
经SSF、PBS-E处理后，大部分粪渣、细菌、白细胞及其它“抗酸体”被去除，CSO着色良好，每显微镜视野可见数十个大小、形态、着色一致的CSO，使结果很易判断。我们改良组建的SSF、PBS-E浓集加SMB、MAF染色法，浓集和检测效果明显优于甲醛沉淀后加MAF法，SSF、浓集加SMB检测与直接SMB法相比阳性预告值提高了35%（即降低了假阳性率），PBS-E浓集加MAF检测，提高了CSO浓度，可弥补直接MAF法敏感性低的缺陷，其敏感性、特异性和准确性均为100％，特别适用于粪便中CSO含量较少的标本检测，检测效果与金标准（IFA）相当，且经济简便，有临床应用价值。
四、SEM观察进一步确认CSO
SEM所见与Reduker等［12］观察结果一致，证实了光镜下的CSO存在，有条件时，SEM观察也是较可靠的诊断方法之一。
五、IFA法的诊断意义
基于单克隆抗体的IFA法无假阳性和假阴性结果［13］，是目前最理想的诊断方法，对首次发现或可疑CSO可提供准确无误的鉴定。但造价高，需有荧光显微镜等设备。
六、ABC染色检测效果
ABC染色技术用于检测粪便中CSO的报道极少，我们建立的ABC法使CSO着色好，背景淡，对比度好，容易辨认。因生物素与亲合素之间有高度亲和力（比抗原-抗体的亲和力大100万倍），具有层层放大效应，敏感性高、特异性强，不需要荧光显微镜，是一种值得进一步研究评价的检测手段。
七、各种纯化CSO技术的作用及意义
纯化后CSO浓度高、纯净，使染色检测容易判断；纯化后CSO仍具有感染活力，为深入进行超微结构、免疫微生物、建立动物模型进行发病机制或药物筛选等研究提供了必要前提。
我们首次经SEM、单克隆抗体（IFA、ABC）鉴定，认为导致重庆地区小儿腹泻的CSO符合小球型（C.parvum）隐孢子虫特点。参考文献
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（收稿日期：1999-07-23）
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