神经源性膀胱M2受体mRNA的变化

【摘要】目的研究犬脊髓损伤后致神经源性膀胱逼尿肌中毒蕈碱样胆碱受体亚型（M2）受体的变化,探讨M2受体在犬神经源性膀胱逼尿肌的意义。方法建立动物模型,设骶上型、骶下型神经源性膀胱组和对照组,RTPCR法半定量检测膀胱体部逼尿肌M2受体mRNA。结果骶上型组膀胱容量（281.0±26.2）mL,逼尿肌压力（58.5±5.7）cmH2O,膀胱顺应性（4.8±1.1）mL/cmH2O;骶下型组容量（513.2±44.4）mL,逼尿肌压力（40.3±4.1）cmH2O,顺应性（12.2±2.1）mL/cmH2O,2组比较有统计学意义（P<0.05）。对照组逼尿肌压力（43.0±3.9）与骶下组比较无统计学意义。对照组膀胱逼尿肌有M2受体mRNA表达,骶上型组和骶下型组M2受体mRNA较对照组增加（P<0.05）,骶上型组明显高于骶下型组（P<0.05）。结论脊髓损伤后神经源性膀胱逼尿肌M2受体增多,骶上型M2受体增多更明显,M2受体可能直接参与骶上型神经源性膀胱逼尿肌无抑制性收缩。

【关键词】膀胱神经源性受体毒蕈碱疾病模型动物RNA信使

神经源性膀胱是临床常见疾病,临床处理棘手。笔者建立犬神经源性膀胱的骶上和骶下型动物模型,运用RTPCR方法半定量检测正常犬和模型犬膀胱逼尿肌中的M2受体mRNA,探讨其变化与意义。

1材料和方法

1.1.1动物家养杂交雌性犬15只,由中山大学北校区动物实验中心提供并饲养（实验动物许可证号为Scxk粤20030001）,体质量（13.5±1.5）kg,随机分为对照组、骶上组和骶下组,各5只。3组间体质量具有可比性。

1.1.2仪器尿动力仪（Ⅳ型,美国LifeTech公司）;数字减影血管造影机（1000MAX型,日本Toshiba公司）;PCR扩增仪（PE9600型,美国PerkinEmer公司）;凝胶成像扫描仪（GelDoc2000型,美国BioRad公司）。

1.1.3引物M2受体和内参GAPDH引物用Primer软件设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列如下:

上游:5'AAGTCAACCGTCACCTCC3'

下游:5'ATCCTCCACAGTCCTCAC3'

上游:5'GATGCTGGTGCTGAGTATGT3'

下游:5'CTTCTGGGTGGCAGTGAT3'

1.1.4试剂Trizol试剂[宝生物工程（大连）有限公司]。第一链cDNA合成试剂盒（立陶宛Fermentas公司）,内含5×ReactionBuffer;dNTPMix（10mmol/L）;Oligo（dT）18Primer（0.5μg/μL）;RandomHemamerPrimer（0.2μg/μL）;ControlPrime（10pmol/μL）;ControlRNA（0.5μg/μL）;DEPCtreatedWater;MMuLVReverseTranscriptase（200U/μL）;RibonucleaseInhibitor（20U/μL）。Marker（上海生工生物工程技术服务有限公司）。琼脂糖,焦碳酸二乙酯（DEPC）（美国Sigma公司）。其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2.1神经源性膀胱动物造模根据文献[1]并加以改进。动物麻醉后,沿L4~6棘突间作纵形切口,暴露L4~6棘突,咬除L5棘突及椎骨,暴露脊髓。骶上型以剪刀完全锐性横断L4~5椎间隙水平脊髓;骶下型在横断脊髓后用探针向下完全钝性破坏横断面以下脊髓,并充填无菌明胶海绵。对照组未行手术。

1.2.2膀胱尿道造影及尿动力学检测造模3个月后行膀胱尿道造影及尿动力学检测。犬麻醉,仰卧位,膀胱置入8F红色尿管,注入76%复方泛影葡胺溶液,在数字减影机器监视下摄片完成造影。以卵圆钳撑开阴户口,暴露尿道外口。7F膀胱测压管经尿道置入膀胱,注射器抽空膀胱尿液。9F直肠测压管置入直肠,充盈气囊。零点压力定为大气压下耻骨联合水平。排除导管内气体,仪器调零。采用微量输液泵经7F膀胱测压管的顶孔向膀胱内匀速（40mL/min）灌注生理盐水,侧孔连接压力换能器,

A:正常;B:骶上型（膀胱容量减少）;C:骶下型（膀胱容量增大）.

以尿道外口出现尿液作为排尿开始的标志,计算机自动测量膀胱容量、逼尿肌压力（膀胱压力直肠压力）及膀胱顺应性（膀胱容量增加值/逼尿肌压力增加值）。