大环内酯类药物治疗铜绿假单胞菌慢性感染机制的研究进展

【摘要】近年来大量研究表明长期应用大环内酯类药物或大环内酯类药物与其它抗生素联用均能有效控制铜绿假单胞菌所致的慢性感染。大环内酯类在治疗铜绿假单胞菌慢性感染方面主要具有：①抑制铜绿假单胞菌藻酸盐和表多糖的产生；②影响铜绿假单胞菌III型分泌系统，减少毒力因子的产生；③破坏铜绿假单胞菌表面结构，抑制细菌对宿主的黏附；④抑制细菌QS系统，减少自身信号诱导分子的合成；⑤增加炎症细胞聚集，减少炎性细胞凋亡，对抗机体的炎症反应；⑥增加呼吸道痰液的清除，降低痰液粘稠度；⑦对铜绿假单胞菌具有暴露时间依从性杀菌活性等方面的功能，能最终达到对铜绿假单胞菌慢性感染的有效控制。

【关键词】大环内酯类；铜绿假单胞菌；感染

ABSTRACTRecentyears,plentyofexperimentshavedemonstratedthatlongtermuseofmacrolideorcombinedwithotherantibioticstherapyinchronicPseudomonasaeruginosainfectionshavehadpositiveresults.ThemechanismsofmacrolidestochronicPseudomonasaeruginosainfectionsislikelyattributabletosevenpredominanteffects:①inhibitionofproductionofPseudomonasaeruginosaalginateandexopolysaccharide;②modulationofbacterialtypeIIIsecretion,reductionofbacterialvirulencefactors;③impairingbacterialcellsurfacestructuresandsurpressingadherencetohostcells;④inhibitionofquorumsensinginPseudomonasaeruginosa,reductionofquorumsensingsignalmoleculesynthesis;⑤increasinginflammatorycellcollection,reductionofinflammatorycellapoptosis;⑥suppressingsputumproduction,decreasingviscosityandimprovingsputumclearance,and⑦exposuringtimedependentkillingPseudomonasaeruginosaacticity.

KEYWORDSMacrolide;Pseudomonasaeruginosa;Infection

1大环内酯类药物对铜绿假单胞菌藻酸盐和表多糖的影响

生物膜的形成是一个动态的过程，包括细菌黏附、微菌落的形成和细胞外多聚基质的包裹等三个过程。细胞外多聚糖是生物膜的主要组成部分，也是细菌耐药的重要原因，藻酸盐是黏液性铜绿假单胞菌生物膜多糖的主要成分，表多糖是非黏液性铜绿假单胞菌生物膜的主要成分。14、15元环大环内酯类对铜绿假单胞菌藻酸盐具有明显抑制作用，14元环大环内酯类克拉霉素和琥乙红霉素使生物膜中多糖、蛋白质和藻酸盐水平下降并呈剂量依从关系，当克拉霉素和琥乙红霉素的药物浓度不小于10mg/ml时多糖、蛋白质和藻酸盐水平均有显著下降，且两者抑制作用无显著差异［1］。琥乙红霉素、克拉霉素和罗红霉素对黏液株生物膜的作用强于非黏液株，阿奇霉素对铜绿假单胞菌生物膜的作用最强，大于或等于1/156最低抑菌浓度（MIC）的阿奇霉素对黏液型铜绿假单胞菌藻酸的产生具有明显的抑制作用，在大于或等于1/16MIC时对非黏液型铜绿假单胞菌生物膜具有明显抑制作用［2］。14、15元环大环内酯类对藻酸盐的抑制作用主要是通过对藻酸盐合成限速酶鸟苷二磷酸D甘露糖脱氢酶酶活性的抑制作用实现的，而16元环大环内酯类则不具此作用，它们的有效作用位点是5位上的糖链结构［3］。

2大环内酯类药物对铜绿假单胞菌III型分泌系统的影响

III型分泌系统包括毒素、色素和表多糖等，它们是铜绿假单胞菌主要毒力因子。铜绿假单胞菌能够分泌多种细胞外毒素，它们能通过对细胞组织的破坏、炎症和对其它局部和全身影响而构成感染发病学。有研究报告用浓度超过0.1～10μg/ml的琥乙红霉素对生长中的细菌作用24h后，虽然对细菌无显著杀灭作用，但是仍能抑制细菌产生弹性酶、蛋白酶和白介素［4］；在另一研究中更进一步证实了浓度为0.125～64μg/ml的琥乙红霉素能够完全抑制弹性酶的产生［5］，阿奇霉素、琥乙红霉素、罗红霉素和罗他霉素一样能抑制铜绿假单胞菌胞外酶和外毒素A，并且阿奇霉素在抑制弹性酶、蛋白酶、卵磷脂酶和脱氧核糖核酸酶的作用方面明显强于其它大环内酯类抗生素，阿奇霉素抑制α脱氧核糖核酸酶的作用亦明显强于琥乙红霉素。琥乙红霉素、克拉霉素和阿奇霉素能抑制绿脓菌素的产生，而罗他霉素、阿波霉素、交沙霉素和竹桃霉素则不具此作用［6，7］。另外在体外实验中证实琥乙红霉素能抑制铜绿假单胞菌D4所产生的外毒素A、全部蛋白酶、弹性酶和磷脂酶C，并存在剂量依从关系［8］。

3大环内酯类抗生素对铜绿假单胞菌表面结构和细菌对宿主黏附性的影响

细菌表面结构包括菌毛、纤毛和鞭毛。铜绿假单胞菌生物膜形成首先要求细菌黏附于宿主黏膜细胞或者是上皮细胞上，最初黏附是由细菌表面结构菌毛和纤毛穿过黏液层与相应的宿主受体相结合而实现的。有研究证明采用1/4MIC的琥乙红霉素仅4h就可显著减少纤毛的数量以及纤毛的黏附［9］。鞭毛能帮助细菌运动到适宜的环境下并产生黏附形成菌落。大环内酯类能在低于最低抑菌浓度下能抑制鞭毛蛋白的表达，有研究报道琥乙红霉素、克拉霉素以及阿奇霉素在低于最低抑菌浓度下能抑制铜绿假单胞菌的运动，而阿奇霉素在1/8最低抑菌浓度时对鞭毛蛋白的抑制作用优于琥乙红霉素和克拉霉素［10］。某些特定的大环内酯类抗生素能改变细胞表面结构，例如脂多糖和外膜蛋白，进而增加该细菌对抗菌药物的敏感性，琥乙红霉素减少脂多糖的作用可以通过检测脂多糖的一个保守蛋白来定量测定，同时琥乙红霉素和克拉霉素还通过减少38KDa蛋白和相伴随的增加41KDa蛋白而使铜绿假单胞菌对血清杀菌活性更加敏感［11］。

4大环内酯类抗生素对铜绿假单胞菌QS系统（专属传感系统）的影响

4.1QS系统与铜绿假单胞菌感染之间的关系

在铜绿假单胞菌中QS系统决定着细菌主要毒力因子的产生和表达，QS系统在细菌的发病学和毒力基因表达的调控中起着重要作用。铜绿假单胞菌具有两个QS系统：las和rhl，其中3oxoC12HSL（含氧十二烷酰高丝氨酸内酯）和C4HSL（丁酰高丝氨酸内酯）是QS系统中的自身信号诱导分子，在慢性铜绿假单胞菌感染患者的痰中能够稳定的检测出自身信号诱导分子3oxoC12HSL和C4HSL［12］。III型分泌系统是铜绿假单胞菌的主要毒力决定因子，而III型分泌系统基因pD（分泌操纵子）、pSpTpYpG（易位操纵子）和pN（插入操纵子）都受RhlRC4HSL的负性调控［13］，细菌纤毛依赖的振颤活动以及细菌细胞外毒素（弹力酶、碱性蛋白和外毒素A）、鼠李糖脂和绿脓菌素的产生与表达都依赖QS系统，另外铜绿假单胞菌对支气管上皮细胞的黏附能力有赖于Rhl系统的存在，并且QS系统在生物膜的分化与成熟中也起着至关重要的作用［14］。

QS系统在铜绿假单胞菌感染时能调节宿主炎症反应。3oxoC12HSL在一定条件下可以成为免疫抑制剂，实验表明它能够抑制脂多糖活化鼠腹膜腔渗出细胞和人类外周血单核细胞产生白介素12和肿瘤坏死因子，当其浓度达到12μmol/L时则能够诱导巨噬细胞和中性粒细胞的凋亡［16～18］。但是3oxoC12HSL又是多形核细胞的有效刺激因子，并且能够刺激人类支气管上皮细胞产生炎症趋化因子白介素8，它还能在体内通过诱导多种炎症趋化因子和化学增活剂而产生一系列复杂的反应，并导致机体的损伤［19］。

4.2大环内酯类药物对QS系统的作用

大环内酯类药物对QS系统的抑制是通过有效抑制QS系统中自身诱导分子的合成来达到对铜绿假单胞菌感染的控制和改变病原体驱动的宿主免疫应答的，如白介素8的产生和中性粒细胞的凋亡。研究表明在对铜绿假单胞菌PAO1的实验中，2μg的阿奇霉素能显著抑制80%lasI和50%rhlI的转录［20］，能将3oxoC12HSL和C4HSL的产生分别降至只相当于对照组的6%和28%的水平，并且阿奇霉素对细菌的这些影响在自然界是具有一定选择性的，琥乙红霉素、克拉霉素和罗红霉素能抑制lasI基因的表达，而竹桃霉素和交沙霉素则不具此功能［21］。

5大环内酯类药物对机体免疫反应的影响

5.1铜绿假单胞菌感染对机体免疫反应的抑制

用光化学反应的方法检测发现相对于游离型铜绿假单胞菌，黏液株和非黏液株生物膜中多形核白细胞数量均显著下降。研究表明黏液株生物膜主要构成成分藻酸盐能阻碍多形核白细胞趋化和吞噬细菌作用，当藻酸盐被酶分解后对多形核白细胞对黏液株的吞噬作用增强，非黏液株生物膜中多形核白细胞数量也减少，破坏生物膜后数量增加［22］。当自身信号诱导分子3oxoC12HSL达到一定浓度是则可诱导巨噬细胞和中性粒细胞的凋亡，导致机体对细菌的清除能力进一步降低。

5.2大环内酯类药物对机体免疫反应的影响

大环内酯类药物能抑制藻酸盐和表多糖的生成，因此能够抑制黏液株和非黏液株铜绿假单胞菌生物膜形成［22］，并且特定的大环内酯类药物还能够抑制QS系统以及其自身信号诱导分子3oxoC12HSL，阻断3oxoC12HSL诱导的巨噬细胞和中性粒细胞的凋亡［16］，增强细胞对细菌的吞噬和杀伤能力。低于最低抑菌浓度的大环内酯类药物能够使黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌生物膜中多形核白细胞数量显著增加，促进多形核白细胞清除细菌，而对游离型铜绿假单胞菌中多形核白细胞影响不大［22］。

相当数量的证据也显示有几种大环内酯类药物能够影响吞噬细胞的功能［23～27］，能影响多形核细胞功能的大环内酯类药物的浓度明显高于它们各自所能达到的血清学浓度，但是一旦琥乙红霉素被活跃的转运至多形核白细胞处，它们在细胞内的浓度就能达到细胞外浓度的若干倍［28］；阿奇霉素在多形核白细胞、肺泡巨噬细胞和成纤维细胞中的浓度高于细胞外环境中浓度的100多倍［29］。但是使用用大环内酯类药物预处理过的多形核白细胞作用铜绿假单胞菌与未处理过的多形核白细胞作用对照却无显著差异。通过大环内酯类药物作用生物膜和周围细菌来提高多形核白细胞吞噬黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌的能力，优于直接使用多形核白细胞本身的治疗效果［22］。

6大环内酯类药物的抗炎活性

琥乙红霉素在没有其它抗生素的前提下能够阻断铜绿假单胞菌感染时炎症细胞因子的产生［30］。CXCL8（多形核白细胞趋化因子）在肺囊性纤维变的发病学中具有重要意义，绿脓菌素通过氧化应激而刺激该因子的产生，阿奇霉素通过抑制绿脓菌素来达到对CXCL8表达的抑制作用。罗红霉素可以通过取代NFκb（核因子κB）与AP1（激活蛋白因子1）结合来减少炎症因子的表达，它能够抑制由各种内毒素刺激巨噬细胞所产生的白介素8，并具有剂量依从性［31，32］。大环内酯类药物抗炎反应活性还与调节中性粒细胞的活动有关，它们可以减少中性粒细胞的凋亡，阿奇霉素不但可以减少中性粒细胞的凋亡还可下调中性粒细胞的氧爆发活动［33］。琥乙红霉素可以抑制人类中性粒细胞弹性蛋白酶活性从而减轻组织的损伤，但是它同时又能激活白介素8的产生。有实验证明每天使用250mg阿奇霉素并连续使用3个月后患者C反应蛋白显著下降［34］。

7大环内酯类药物对呼吸道痰的粘稠性和清除率的影响

大环内酯类药物可以抑制痰液的产生，降低其粘稠度和促进其清除，其中罗红霉素和阿奇霉素都具有明显疗效，但是琥乙红霉素则不具显著疗效，其中阿奇霉素尚存在着剂量依从性关系［31］。

8大环内酯类药物的暴露时间依从性杀菌活性

基于传统的抗微生物实验操作，大环内酯类药物不展现固有的抗铜绿假单胞菌活性，但是在与其它抗生素联合使用治疗多重耐药菌时却可观察到附加和协同作用。大环内酯类药物长期潜伏在细菌内可以降低铜绿假单胞菌的生存能力［35］，用阿奇霉素作用48h或采取剂量依从方式可明显降低铜绿假单胞菌PAO1的生存能力，但是时间小于24h或浓度过h影响不明显，只有特定的大环内酯类具有这种时间依从性，如：琥乙红霉素、克拉霉素和阿奇霉素，而其它大环内酯类药物则不具有此特点。这种细菌生存能力的减退是与细菌蛋白合成下降相联系的，而细菌蛋白合成的下降又与细菌内时间依从性抗生素的蓄积有关。更有甚者，大环内酯类药物蓄积可导致细菌应激反应，这些抗生素可导致主要的应激蛋白发生改变，导致细菌生存能力的下降［36］。大环内酯类药物的暴露时间依从性杀菌活性也说明了为何起临床疗效的大环内酯类药物的剂量与实验室的最低抑菌浓度评估之间存在差异。