伯基特淋巴瘤与EB病毒的关系及其p53和bcl-2蛋白的表达

伯基特淋巴瘤与eb病毒的关系及其p53和bcl-2蛋白的表达

中华病理学杂志1998年第4期第27卷*论著*

作者：李佩娟崔全才王志永何乐健刘淑荣刘彤华

单位：*论著*

关键词：伯基特淋巴瘤；疱疹病毒4型；人；dna；病毒；蛋白质p53；蛋白质bcl-2

【摘要】目的了解伯基特淋巴瘤和eb病毒的关系及p53和bcl-2蛋白的表达。方法采用pc、原位pc及免疫组化lsab方法,检测了28例伯基特淋巴瘤石蜡包埋的组织块。结果发现8例eb病毒dna阳性,阳性率为28.5%,8例阳性病例做了原位杂交,其中3例为阳性。27例做了p53和bcl-2免疫组化检测,阳性病例各为12例(44.4%)和13例(48.1%)。ⅰ～ⅱ期和ⅲ～ⅳ期p53和bcl-2阳性病例分别为3例(23.0%)、9例(64.2%)和3例(23.0%)、10例(71.4%),两者均表现ⅲ～ⅳ期阳性率高于ⅰ～ⅱ期。χ2检验:p＜0.05,差异有显著性。eb病毒、p53和bcl-2同时阳性的有4例,eb病毒和p53同时阳性的有5例,eb病毒和bcl-2同时阳性的有4例,p53和bcl-2同时阳性的(包括eb病毒、p53和bcl-2同时阳性的病例在内)共有9例,即eb病毒阳性的病例有半数以上合并p53和bcl-2阳性,而p53和bcl-2则有70%左右阳性病例同时有阳性表达。结论肿瘤内eb病毒dna阳性率和非洲型伯基特淋巴瘤不同,而和世界各地报道的散发型相似；肿瘤内p53和bcl-2表达ⅲ～ⅳ期明显高于ⅰ～ⅱ期;eb病毒、p53和bcl-2之间可能存在某些相互的影响。

thecoelationbetweenbukitt′slymphomaandepstein-baviusin28casesandtheiexpessionofp53andbcl-2poteinslipeijuan*,cuiquancai,wangzhiyong,etal.*depatmentofpathology,beijingchilden′shospital,beijing100045

【abstact】objectivetoinvestigatethecoelationbetweenbukitt′slymphomaandepstein-ba(eb)viusanditsexpessionofp53andbcl-2poteins.methodspolymeasechaineaction(pc),insitupcandimmunohistochemicaltechniquesweeappliedtospecimensfom28casesofbukitt′slymphomasonpaaffin-embeddedsections.esultsebviuswasfoundin8(28.5%)casesbypc,ofwhich3weepositivebyinsitupc.positiveatesfotheexpessionofp53andbcl-2wee44.4%and48.1%espectively.wheeasinstagesⅰ-ⅱandⅲ-ⅳ,theywee3(23.0%),9(64.2%)and3(23.0%),10(71.4%)espectively.boththeexpessionofp53andbcl-2weehighinstagesⅲ-ⅳ,lowinstagesⅰ-ⅱ(p＜0.05).thepositivecasesofebviusincombinationwiththeexpessionofp53andbcl-2potein,p53poteinandbcl-2poteinwee4,5,4espectivelyand9casesweepositivefop53andbcl-2potein.inothewods,thepositivecasesfoebviusincombinationwiththeexpessionofp53andbcl-2wee50%,wheeas70%weepositivefobothp53andbcl-2.conclusionsthepositiveatesofebviusinouseiesaediffeentfomsomeepotsofafican-bukitt′sandsimilatomanyotheepotsofendemicbukitt′slymphoma.theexpessionofp53andbcl-2poteinsaesignificantlycoelatedwithstage;highinstagesⅲ-ⅳandlowinstagesⅰ-ⅱ.ebvius,p53andbcl-2poteinsmayaffecteachothe.

【keywods】bukitt′slymphomahepsvius4,humandna,viualpoteinp53poteinbcl-2

淋巴瘤是小儿时期最常见的恶性实体瘤之一，伯基特淋巴瘤又是小儿非hodgkin淋巴瘤中较常见的一型，此瘤属于未分化型小无核裂细胞淋巴瘤。恶性度高，病变发展迅速，多数病人预后很差，国外曾有很多报道，国内报道不多。伯基特淋巴瘤与eb病毒的关系及其p53和bcl-2的表达报道不多［1，2］，我们复查了北京儿童医院病理科从1956年至1991年小儿淋巴瘤的材料,将其中典型的伯基特淋巴瘤28例进行了临床病理资料的分析,用pc方法将石蜡包埋的组织块进行了eb病毒dna检测,并检测了肿瘤的免疫表型和p53及bcl-2蛋白的表达。

材料与方法

1.复查了1956～1991年54例伯基特淋巴瘤，挑选临床病理资料完整的28例进行以下各项检测。

2.eb病毒检测：dna模板的提取：石蜡包埋组织,一次性刀片5μm厚切片,取3～5张蜡膜,放入1.5ml离心管中,常规二甲苯脱蜡,梯度乙醇入水,离心后组织用400μlpk缓冲液悬浮,70℃水浴10分钟,自然次序冷却后加蛋白酶k,55℃消化3小时,等体积酚抽提,上清液加入2倍体积乙醇,0.2mol/lnasc沉淀,12000/min离心,te重溶沉淀。(1)pc扩增：30μlpc扩增体积中含pc缓冲液,200μmol/ldntp,50pmol/l扩增引物(tc60:ccagaggtaagtggactt,tc61:gaccggtgccttcttagg,北京医科大学生化系合成),0.2μg模板dna,0.25utagdna聚合酶,经94℃1分钟,55℃1分钟,72℃1.5分钟扩增30个循环。电泳鉴定及southen转印：0.8μl扩增产物,经3%琼脂糖凝胶电泳后，20μl阳性病例扩增产物经琼脂糖电泳,照像后,经southen转印至硝酸纤维素膜上后,用α-p-dctp标记ebv-banw核酸探针杂交后,经严格冲洗,放射自显影后观察结果。(2)原位杂交：对pc扩增ebv检测阳性的8例进行原位杂交,aji细胞为阳性对照,p-2细胞为阴性对照,石蜡包埋组织5μm厚切片,常规脱蜡脱水,pbs冲洗,0.1mol/lhcl10分钟后,蛋白酶k消化37℃10分钟,梯度乙醇脱水,42℃预杂交2小时后加杂交液40～80μl/片,42℃过夜杂交,严格冲洗后,经脱水、自然干燥，涂核-4乳胶,放射自显影7～10天后,d-76显影、定影,he复染观察。原位杂交探针标记：1850kbqα-s-dctp(杜邦公司),随机引物标记方法标记ebv-banw核酸探针(pomega公司标记盒)。

3.用免疫组化方法检测肿瘤的白细胞共同抗原(lca),uchl-1和l26,确定其免疫表型，p53和bcl-2蛋白,l26,uchl-1,lca和bcl-2为dako公司产品,p53为santacuzbiotechnology公司产品,stmp试剂盒为zymed公司产品。p53和bcl-2在组织脱蜡复水后用0.01mol/l枸橼酸钠水浴煮至90℃10分钟，自然冷却10分钟后进行lsab法免疫组化染色(步骤略)。检测结果28例有1例肿瘤蜡块只剩边缘结缔组织,故取消,只剩27例。阳性反应的评估:肿瘤细胞阳性观察标准：0%～25%为±,25%～50%+,50%～75%++，＞75%+++。

4.统计学处理用卡方(χ2)检验法。

结果

1.临床资料:男21例,女7例,男女之比为3∶1。发病年龄以2岁至13岁,2～5岁10例,6～9岁9例,10～13岁9例。病变部位:腹部13例,包括回肠7例(其中3例表现肠套叠症状和体征),肠系膜淋巴结5例,腹腔1例;颈淋巴结5例;腹股沟淋巴结1例(其中1例伴有颅神经ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅵ损害和下肢瘫痪);鼻咽部2例;纵隔1例。病期：根据annabo分期标准:ⅰ期:7例,表现为单纯的局部肿物。ⅱ期:6例,表现为局部肿物和附属淋巴结肿大。ⅲ期和ⅳ期:14例,有2个或2个以上部位肿块,伴有或无全身症状。

2.病理表现:28例全部表现为典型伯基特淋巴瘤的病理形态,瘤细胞大部分为一致的小圆细胞,核膜较厚,核染色质粗糙,核仁清楚,呈弥漫排列,肿瘤细胞之间可见星天状分布的巨噬细胞(图1),肿瘤细胞之间尚可见到点状或片状坏死。免疫组化染色：27例全部表现为b细胞免疫表型,阳性细胞除1例在50%以下外,其余阳性表达在50%以上。

3.eb病毒检测：28例肿瘤dnapc扩增产物中有8例在122bp有特异性扩增带,并经southenblot证实产物为ebv-banw(图2，3),阳性率为28.5%。8例阳性病例原位杂交结果,3例阳性(图4)。阳性信号主要分布在肿瘤细胞胞浆及胞核内，信号强度不等,最多者50%。原位杂交阳性的3例,2例发生于结外,1例发生于结内。

4.p53检测结果：27例中12例表达50%以上有意义的阳性(图5),阳性率为44.4%,按病期分ⅰ～ⅱ期病人,13例中阳性有3例,阳性率为23.0%,ⅲ～ⅳ期14例病人有9例阳性,阳性率为64.2%。

5.bcl-2检测结果:27例中13例表达50%以上有意义的阳性,阳性率为48.1%。按病期分：ⅰ～ⅱ期病人13例,阳性3例,阳性率23.0%；ⅲ～ⅳ病人14例,阳性病人10例,阳性率71.4%。

6.p53和bcl-2检测结果：ⅲ～ⅳ期阳性率明显高于ⅰ～ⅱ期病人,χ2检验结果p＜0.05,差异有显著性。

eb病毒、p53和bcl-2同时阳性4例,eb病毒和p53同时阳性5例,eb病毒和bcl-2同时阳性4例,即eb病毒阳性的病例有半数以上同时合并p53和bcl-2或其中之一阳性,p53和bcl-2同时阳性的

图1瘤细胞由大小一致的小圆细胞构成，核膜较厚，核染色质粗糙，核仁清楚，弥漫排列，瘤细胞之间散在星天状分布的吞噬细胞he×800图5p53染色显示胞核内棕黄色阳性物质lsab法×800

m1：pb322/hinfimake,aji：阳性对照细胞(下同)，

1～8为病例号,m2:pb322/bstnimake

图28例伯基特淋巴瘤pc扩增产物凝胶电泳结果

图3图2中凝胶经southenblot，与α-p-dctp标记ebv-banw核酸探针杂交放射自显影结果

图42-s-datp标记ebv-banw探针，瘤细胞胞浆内及核内有eb病毒感染原位杂交×1500

病例,包括eb病毒、p53和bcl-2同时阳性的病例在内共有9例,即p53和bcl-2同时表达阳性的占其阳性病例的70.0%左右。原位杂交阳性的3例有2例同时有p53和bcl-2阳性表达,另1例原位杂交阳性病例合并p53阳性表达,bcl-2为阴性。

讨论

病源学研究发现伯基特淋巴瘤和eb病毒关系非常密切,80%～90%的病人发现eb病毒基因和血液循环内eb病毒抗体［3］。此后世界各地也相继报道了与非洲淋巴瘤相似的病例,但肿瘤发生部位及其与eb病毒的关系和前者稍有不同。前者称为非洲型伯基特淋巴瘤,后者称为散发型或非非洲型伯基特淋巴瘤。和非洲型相比,非非洲型最常见的发病部位为腹部,eb病毒dna的阳性率只有20%左右［3］。我们的材料和国外报道的非非洲型相似,eb病毒阳性率为28.5%,病变也以侵犯腹部为主。

eb病毒和许多肿瘤关系很密切。除病毒相关因素外,最近很多研究表明,染色体和癌基因的突变与许多肿瘤的发生和病变的进展、治疗效果及病人预后关系非常密切［4，5］。

p53是肿瘤的抑癌基因。p53突变是人类恶性肿瘤最常见的基因改变。由于癌基因的突变,使p53从抑癌基因转化成肿瘤基因。许多报道表明p53的突变或过度表达对淋巴瘤的发生和病变的进展起重要作用［5，6］。p53的突变多见于高度恶性的淋巴瘤,少见于低度和中度恶性淋巴瘤［7］。从病期看,ⅲ～ⅳ期病人阳性率时显著高于ⅰ～ⅱ期。

原癌基因bcl-2已证实为凋亡相关基因。这种基因首先发现与滤泡型非hodgkin淋巴瘤密切相关,因而命名为b细胞淋巴瘤-2。这种基因正常位于第18对染色体,由于染色体7(14;18)转位,造成bcl-2蛋白水平增高［4，8］。有报道，bcl-2的表达和肿瘤细胞分化程度、病变的进展、病人对治疗的反应及预后关系密切［9］。本组病人48.1%bcl-2呈阳性反应,从病期分析,bcl-2和p53相似,阳性病例多见于中晚期病人。

eb病毒阳性的病例有半数(4例)同时合并p53和bcl-2阳性,有70%左右的病例p53和bcl-2同时表达阳性。muay等［8］曾报道，器官移植后淋巴组织增生性疾病包括淋巴瘤。他们发现eb病毒可以引起bcl-2的表达。从本组材料看,eb病毒、p53和bcl-2之间可能存在一些相互的影响。

参考文献

1bogedainc,alligep,schwazmannf,etal.diffeentactivationofepstein-baviusimmediate-ealyandealygenesinbukitt′slymphomacellsandlymphoblastoidcellline.jviol,1994,68：1200-1203.

2owem,owedt,gegoycd,etal.diffeencesinbcellgowthphenotypeeflectnovelpattensofepstein-baviuslatentgeneexpessioninbukitt′slymphomacells.emboj,1987,6：2743-2751.

3dehnelp.pediaticsugicalpathology.2thed.bultimoe:williams＆wilkins,1987.825-837.

4yunisj,mayemg,anesenma,etal.bcl-2andothegenomicaltenationinthepognosisoflagecelllymphoma.nengljmed,1989,320：1047-1054.

5faugiamm,duanlj,eismd,etal.alteationsofp53tumosuppessogeneindiffuselagecelllymphomaswithtanslocationofthec-mycandbcl-2poto-oncogenes.blood,1994,83：191-198.

6icikawaa,hottat,takaginoio,etal.mutationsofp53geneandtheielationtodiseasepogessioninb-celllymphoma.blood,1992,79：2701-2707.

7saidjw,baea,sinlakuip,etal.immunohistochemicalanalysisofp53expessinmalignantlymphomas.amjpathol,1992,141：1343-1348.

8muaypg,swinnenlj,constandinoucm,etal.bcl-2butnotitsepstein-bavius-encodedahomologue,bhf1,iscommonlyexpessedinposttansplantationlymphopolifeativedisodes.blood,1996,87：706-711.

9hemineo,haiounc,lepagee,etal.pognosticsignificanceofbcl-2poteinexpessioninaggessivenon-hodgkin′slymphoma.blood,1996,87：265-272.

(收稿：1997-01-13修回：1997-10-22)

（责任编辑：jbwq）