肿瘤异位激素分泌的机制主要有两方面,一是肿瘤的发生机制;二是肿瘤发生后肿瘤细胞异常分泌激素的机制。同样,异位ACTH的机制研究亦不外乎此两方面。
首先,我们对肿瘤发生机制进行研究。本课题组利用基因芯片技术,建立了导致异位ACTH综合征的胸腺类组织与正常胸腺组织的差异基因表达谱。结果显示,403个基因在异位ACTH综合征的胸腺类癌组织中高表达,394个基因表达2倍以上,其中23个基因与细胞分裂有关;51个基因表达5倍以上,其中与细胞分裂有关的基因1个,即PAK3。由此提示,引起异位ACTH综合征的胸腺类癌组织与正常胸腺组织存在多个差异表达的基因,PAK3可能参与了该胸腺类癌肿瘤的发生。应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印记（WesternBlot）方法均证实了PAK3在胸腺类癌组织的高表达。进一步研究发现,PAK3可以激活ERK1和ERK2,磷酸化ERK1和ERK2明显增多,后者可以促进细胞增生。
继而,本课题组对胸腺类癌可异常分泌ACTH的机制进行研究。ACTH是由阿片-促黑素细胞-皮质素原（POMC）水解生成的。POMC基因位于染色体2p23,具有生物活性的mRNA长约1200bp。POMC的基因表达具有组织细胞特异性,生理情况下只有垂体和下丘脑的POMC基因能够在垂体特异性启动子作用下,编码具有生物活性的POMC蛋白质。而垂体外组织虽然存在POMC基因的转录生成mRNA长度为800bp的转录本,缺少信号肽序列,所以没有生物活性。垂体特异性的POMC启动子在垂体和下丘脑以外的组织被激活时,这些组织细胞便会分泌具有生物活性的POMC相关蛋白,从而发生异位ACTH综合征。
本课题组还观察了POMC基因启动子区CpG岛甲基化的改变。CpG岛是指在500～2000个碱基中G+C的含量超过50%的序列。DNA序列的甲基化通过与甲基化结合蛋白和CpG岛结合蛋白作用,改变DNA的三维结构从而抑制基因转录,减少基因编码蛋白质的表达。反之,CpG岛低度甲基化时,蛋白表达增加。POMC基因启动子+21到-417之间的区域在DMS-79和AtT-20细胞中具有完整的启动子活性。这个区域位于前述的CpG岛范围内。我们使用重硫酸盐直接测序的方法发现正常胸腺组织POMC基因启动子-417到-260之间的区域高度甲基化,而胸腺类癌组织的这个区域则是低度甲基化,甚至完全未甲基化。为排除这种低度甲基化的状态是肿瘤组织普遍的一种现象,我们分析了1例没有POMC基因表达的大细胞肺癌组织的甲基化情况,结果发现POMC基因启动子几乎每个CpG位点都呈完全甲基化状态。甲基化的CpG岛可以结合甲基化CpG结合蛋白和转录抑制因子,阻断POMC基因转录起始所需要的转录因子,从而抑制基因转录。本研究POMC基因在5例胸腺类癌（以TC命名）组织中均高度表达,其中TC4表达水平升高的最为明显,同时它的启动子区呈完全去甲基化状态;而在启动子区完全甲基化的大细胞肺癌,POMC基因的表达水平则几乎是完全缺如的。POMC基因在4例胸腺类癌组织中的表达水平高低依次如下排列TC4<TC1<TC2<TC5,-417到-260之间的甲基化水平也基本按照上述次序依次降低,表明POMC基因的表达水平是与其启动子区的甲基化水平呈负相关,即POMC基因启动子区的甲基化水平可能决定了基因的表达水平。在TC5病人的胸腺类癌组织POMCmRNA序列中检测到798位点存在C/T双峰,提示POMC基因的转录本来源于父亲和母亲两个等位基因,不存在基因印记的现象,因而也说明这种甲基化的差异并不是等位基因特异的,与基因印记无关。
DNA修饰的改变只是基因转录的先决条件,基因的最终激活还是需要各种转录因子的协同作用。Tpit是目前惟一具有严格组织细胞特异性的POMC基因转录因子,只在垂体前叶分泌ACTH的细胞表达,也是在胸腺类癌组织和DMS-79细胞中惟一与POMC基因表达呈正相关的转录因子,提示Tpit不仅是垂体促肾上腺皮质细胞分化发育所必需的,可能也是胸腺类癌和小细胞肺癌向分泌ACTH方向发育所必需的。在垂体细胞中,Tpit可以协同Pitx1启动POMC基因的转录,但在胸腺类癌组织中均未发现Pitx1的表达,提示存在其他机制发挥启动作用。
总之,胸腺类癌组织POMC基因启动子DNA甲基化程度降低,为相关转录因子的结合提供了先决条件。Tpit等组织细胞特异性转录因子的表达等机制,使POMC启动子活化,激活POMC基因转录,从而在垂体外产生ACTH。
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