单侧输尿管结扎大鼠体内调节性T细胞的表达改变及意义研究

【摘要】目的研究单侧输尿管结扎大鼠体内外周血和脾脏调节性T细胞的表达改变及意义。方法通过单侧输尿管结扎构建肾脏炎症、纤维化模型，肾脏Masson染色评价肾脏间质损伤的程度，流式细胞仪检测单侧输尿管结扎大鼠体内调节性T细胞的表达改变。结果Masson染色发现，单侧输尿管结扎3天出现肾脏间质炎症细胞浸润，7天出现大量炎症细胞浸润，并出现纤维化，14天肾脏出现明显纤维化，脾脏和外周血的调节性T细胞数目在结扎输尿管后3天、7天、14天均明显增加（P<0.05）。结论调节性T细胞数目的改变可能参与了肾脏间质炎症、纤维化的发生发展过程。

【关键词】肾间质纤维化；调节性T细胞；单侧输尿管梗阻

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionoftheregulatoryTcells（Tregs）inratwithunilateralureteralobstruction（UUO）anditssignificanceinrenalinterstitialfibrosis.MethodsThirty-fivemaleWistarratswererandomizedintonormal,UUOandshamoperationgroups（SOR）.Thekidneyswereharverstedat3,7,and14daftertheoperation，atthesametime,thebloodandthespleenwereobtained.TheratioofTregswasmeasuredbyflowcytometry（FCM）.Massonstainingwasusedontherenaltissuetoobservehistologicalchanges.ResultsComparedwiththenormalandSORgroup,therewasasignificantincreaseinTregsexpressionintheUUOgroup（P<0.05）.Interstitialmacrophageinfiltrationwasobservedat3dafteroperation,interstitalfibrosiswasobservedat7dafteroperation,andbecameintenseat14dafteroperation.ConclusionElevatedTregsexpressionmightberesponsibleforthemacrophagesinfiltrationandinterstitialfibrosisintheobstructedkidney.

【Keywords】renalinterstitialfibrosis;regulatoryTcells;unilateralureteralobstruction　

调节性T细胞（regulatoryTcells,Tregs）是一群具有免疫调解或免疫抑制功能的细胞。Tregs数量和功能的失调可能参与许多自身免疫性疾病的发生［1］。肾小管间质损伤是各种炎性肾脏疾病进展至终末期肾病（ESRD）的共同通路，其病变过程是以肾间质炎细胞浸润和小管损伤并最终导致肾纤维化、肾失功为共同特征。大量研究证实肾小管间质损害程度与慢性肾脏病（CKD）患者的肾功能损害程度成正相关。因此，近年来干预肾小管间质损伤的进展成为目前保护肾功能、延缓CKD进展的主要治疗靶点。单侧输尿管结扎（UUO）导致的持续性输尿管梗阻对肾脏的影响以肾小管间质损害为主，目前的研究表明，早期巨噬细胞介导的炎症和晚期TGFβ1（转化生长因子）诱导的肾间质纤维化是UUO致病的主要因素，该模型中，肾间质炎症细胞浸润所致的炎症是该模型的始动和核心事件［2,3］。

本研究拟通过构建UUO大鼠模型，通过流式细胞仪检测UUO大鼠的外周血和脾脏的调节性T细胞的数量，肾脏组织Masson染色评价肾间质损害的程度，了解调节性T细胞在UUO大鼠肾脏间质损伤中的意义。

1材料与方法

1.1UUO大鼠模型的构建取Wistar大鼠（购自中科院动物所）35只，分三组：正常组5只，假手术组15只，单侧输尿管结扎组15只。大鼠重量约150g，氯胺酮、速眠新依次麻醉动物，腹部正中切口，沿右肾下沿水平双线结扎输尿管，关腹。假手术组不结扎输尿管，余步骤同前。术后3天、7天、14天处死动物，取外周血和脾脏流式细胞仪检测，取肾脏组织，4％多聚甲醛固定，依次脱水、透明、石蜡包埋。

1.2流式细胞仪检测调节性T细胞的数目CD4（CY5标记）、CD25抗体（PE标记）购自基因公司，脾脏应用PBS缓冲液冲洗2次，依次用200目、400目滤器制成细胞悬液，取（1～2）×106个细胞加至100μl体积，加CD4、CD25抗体孵育30min，外周血取50μl全血，加CD4、CD25抗体孵育30min，加红细胞裂解液裂解红细胞，PBS洗1次，1％多聚甲醛固定，流式细胞仪（上海交通大学医学院分子生物学教研室）检测CD4、CD25阳性细胞数。

1.3肾脏组织Masson染色评价肾间质损害的程度肾脏石蜡切片4μm，常规脱蜡至水，应用Masson染色试剂盒（购自上海虹桥试剂站），苏木素染色3min，水洗10min，第2液染色3min、第3液冲洗至无色，第四液染色2min，第3液冲洗，第5液染色3min后弃液，95％酒精略洗，100％酒精脱水，透明封片。

1.4统计学分析用SPSS1115软件对数据进行分析处理,计量资料用x±s表示,方差齐者,多组间采用one2wayANOVA,组间两两比较用LSD法。