核酶和RNA干扰靶向治疗慢性粒细胞性白血病的实验研究

【摘要】：核酶和RNA干扰靶向治疗慢性粒细胞性白血病的实验研究研究目的利用带有导引序列（GS）的RNaseP亚单位M1RNA（M1-GSRNA）和RNA干扰技术（RNAinterference,RNAi）靶向作用于具有特征性靶基因BCR-ABLmRNA的慢性粒细胞性白血病（chronicmyelogenousleukemia,CML）细胞株K562细胞，观察它们对于靶基因及其表达产物的切割效果及细胞凋亡的变化，探索CML靶向治疗的新方法。研究方法1．M1-GSRNA细胞外切割实验和含M1-GSRNA模板序列真核表达载体的构建设计BCR-ABLmRNA融合区域为GS识别靶点，以pTK117为模板（含M1RNA模板序列）通过PCR方法合成M1-GSRNA模板序列，克隆到pUC19上得到pGS210；人工合成与BCR-ABLmRNA融合位点前后序列25个碱基同源的一段DNA模板，克隆到含有T7启动子的pGEM-7zf（+）上，得到pBCR-ABL；pGS210和pBCR-ABL均经限制性酶切和测序鉴定，然后进行细胞外转录，将二者转录产物按照一定摩尔比例混合，进行细胞外核酶切割实验，利用放射自显影检测切割效率和作用的特异性；将M1-GSRNA模板序列克隆到真核表达载体pNAV-1上，得到pAVGS4，进行大量抽提、纯化。2．检测pAVGS4转染K562细胞后不同时间BCR-ABLmRNA和p210表达的变化以X-tremGENEQ2介导pAVGS4和pNAV-1（作为空白对照）转染K562细胞株，转染后24、48、72和96小时分别收集细胞，以Trizol法抽提总RNA，作RT-PCR（人源性β-actin作为内参照）通过半定量比较转染后不同时间BCR-ABLmRNA量的变化；收集转染后48小时和96小时实验组和对照组的细胞，抽提蛋白质，作WesternBlotting，比较不同时间BCR-ABL的表达产物p210在量上的变化。3．检测转染核酶后不同时间细胞凋亡的变化：收集转染后24、48、72、96小时的细胞，分别应用AnnexinV-FITC+PI染色和TUNEL-FITC法通过流式细胞术检测细胞凋亡情况，比较不同时间细胞的凋亡率；收集转染后72小时实验组和对照组的细胞，通过透射电子显微镜观察法比较两组细胞形态的变化。4．含有siRNA模板序列RNA表达载体的构建及对K562细胞的作用效应以BCR-ABLmRNA融合区域为作用位点，根据小干扰RNA（smallinterferingRNA，核酶和RNA干扰靶向治疗慢性粒细胞性白血病的实验研究siRNA）模板的设计原则，设计、合成2条寡核昔酸链，退火后构建到psilencerl.0-u6上，经限制性酶切和测序鉴定，大量抽提纯化，以x一tremeGENEQZ转染K562细胞;收集转染后45和72小时的细胞，分别应用AnnexinV-FITC+pl染色和TLJNEL一FITC法通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。研究结果1.含有Ml一GS州A模板序列的pGSZ10和含有底物序列的pBCR一ABL经限制性酶切分析和测序鉴定证实构建成功;进行细胞外转录和切割实验，通过放射自显影检测显示:Ml一GSRNA与人工底物按照1:5的当量进行混合4小时的切割率为28.6%，以1:1的比例混合4小时的切割率为782%，对照组抗MHC的MIRNA对于人工底物无切割作用;构建的质粒pAVGS4经限制性酶切分析和测序鉴定证实构建成功，大量抽提纯化后的产物浓度和纯度符合转染要求。2.在p脚GS4转染K562细胞后24、48、72和96小时，作l干卜PeR分析显示:在转染后24小时，实验组细胞内BCR一ABLmRNA随时间的延长含量下降近1个对数级，72和96小时时BCR-ABLmRNA的含量接近，而对照组无明显改变。W七stemBlotting分析显示:实验组在48小时的灰度是同期对照组的10.4%，%小时时为6.7%。3.凋亡分析:转染72小时实验组和对照组的细胞作电镜分析，在实验组见到大量凋亡细胞，而对照组少见;应用ArmexinV十PI法检测凋亡，在转染24、48、72和%小时的凋亡率分别为4.5%、20.1%、423%和56%（p0.0001），而对照组在不同时间的凋亡率5%一6%印0.05）;通过TUNEL法检测上述时间的凋亡率实验组分别为:5.6%、24.礴%、43.20，0和58.4%（P0.0001），对照组的凋亡率在6%~9%（p0.05）。4.RNAi对于K562细胞凋亡的影响:构建含有siRNA模板的pBCR6载体经限制性酶切分析和测序鉴定，载体内含有目标序列;经大量抽提纯化后检测pBcR6的浓度和纯度符合转染要求;在转染48和72小时应用AnnexinV+PI染色检测凋亡率为:25.5%和48.0%（P0.01），而对照组分别为6.5%和6.7%（P0.05）:应用TtJNEL法检测2个时间的凋亡率为29.8%和53%印0.01），对照组为7.9%和8.9%（P0.05）。研究结论1.本实验己成功构建含有Ml一GSRNA模板序列的真核表达载体pAVGS4，进行细胞外切割实验显示具有特异性切割底物的效应;2.将pAVGS4转染K562细胞株后发现Ml一GSRNA具有特异性切割BcR一ABLmRNA作用，而且随着时间的延长切割效率增加，但72小时和96小时时作用接近;进行PZ10蛋白检测，发现Ml一GSRNA可以有效地下调该蛋白质的表达。丛塑塑旦NA干扰靶向治疗慢性粒细胞性白血病的实验研究3.应用多种方法检测发现转染pAvGs4可以有效地诱导K562细胞凋亡，在转染24小时后随着时间的延长，实验组的凋亡率显著增加;表明Ml一GSRNA具有