【摘要】 目的探讨毒素清颗粒对内毒素肺损伤家兔小肠组织巨噬细胞炎症蛋白2信使核糖核酸（MIP2mRNA）表达的影响。方法静脉注射脂多糖建立家兔肺损伤模型。大耳白兔36只，随机分为空白对照组、模型组、毒素清大中小剂量组、双黄连组，每组6只。采用原位杂交技术测定MIP2mRNA表达水平。结果与对照组比较，模型组小肠组织MIP2mRNA表达明显上调（P＜0.01）；与模型组比，毒素清大、中剂量组MIP2mRNA表达明显减弱（P＜0.01）。结论内毒素肺损伤家兔小肠组织MIP2mRNA表达显著增强。毒素清能抑制MIP2释放，减轻炎症反应。
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【关键词】肺损伤；毒素清；MIP2mRNA
EffectofDusuqinggranuleontheexpressionofMIP2mRNAatsmallintestineofrabbitwithendotoxininducedlunginjury
LISuYun,LIJianSheng,WANGXiangYu,etal.
LabRespiratoryoftheFirstAffiliatedHospital,HenanTraditionalChineseMedicalCollege,Zhengzhou450000,Henan,China
【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofDusuqinggranuleontheexpressionofMIP2mRNAatsmallintestineofrabbitwithendotoxininducedlunginjury.MethodsRabbitmodelwithlunginjurywasmadebyintravenousinjectionoflipopolysaccharide.36rabbitswererandomlydividedintocontrol,model,Dusuqinglarge,middleandsmalldoseandShuanghuangliangroups.TheexpressionofMIP2mRNAwasmeasuredbyinsituhybridization.ResultsComparedwithcontrolgroup,theexpressionofMIP2mRNAinmodelgroupwasupregulatedobviously（P＜0.01）.Comparedwithmodelgroup,theexpressionsofMIP2mRNAinDusuqinglargeandmiddledosegroupsweredownregulatedobviously（P＜0.01）.ConclusionsTheexpressionofMIP2mRNAatsmallintestineisincreasedmarkedlyinrabbitwithendotoxininducedlunginjury.DusuqinggranulecaninhibitthereleaseofMIP2andrelieveinflammationreaction.
【Keywords】Lunginjury;Dusuqinggranule;MIP2mRNA
内毒素在革兰阴性菌感染导致的急性肺损伤中起主要作用，在其引起的组织损伤的一系列病理生理改变中，小肠是其中的一个重要环节。肠道菌群代谢产物过多或经肠道屏障进入人体循环，形成内源性内毒素血证〔1〕，无论外源或是内源性内毒素血证小肠损伤均是突出表现之一〔2〕，而小肠损伤时肠道屏障首先被累及，又引起细菌易位，形成内源性内毒素血证，导致多器官障碍综合征，加重病情。因此近年来有研究称肠道不仅是消化吸收的重要场所，同时也是“应激反应的中心器官”、多脏功能衰竭的始动器官〔3〕，抗内毒素药物研究和内毒素引发疾病的治疗一直是世界医药界重点研究课题。80年代以来，内毒素致病的分子机制研究已取得了许多新进展，但目前尚无有效的方法能从根本上控制内毒素的生物活性。因此开展内毒素致病机制研究及运用中医药对其进行干预，对于揭示内毒素致病的病理生理学机制及指导中医药的临床应用具有十分重要的意义。毒素清颗粒（由人参、瓜蒌、麦冬、生地、鱼腥草、白头翁等组成）具有清热解毒、益气养阴功效。已往的研究表明:毒素清颗粒具有解热抗炎和提高机体免疫功能的作用,可显著降低肺组织WBC和中性粒细胞（N）数量,抑制细菌的作用,并抵抗细胞因子介导的组织损伤，治疗老年肺炎效果显著。前期研究已表明毒素清能显著抑制肺损伤兔小肠炎性因子巨噬细胞、TNFα、细胞黏附分子（ICAM1）、血管间黏附分子（VCAM1）的表达，减轻炎症反应（均已另文发表），本课题旨在采用原位杂交技术从巨噬细胞炎症蛋白2信使核糖核酸（macrophageinflammatoryprotein2mRNA，MIP2mRNA）表达变化揭示毒素清颗粒对内毒性小肠损伤保护作用的分子机制。
1材料与方法
1.1实验动物和主要试剂
健康雄性42月龄日本大耳白兔，体重（2.0±0.2）kg，由河南省科学技术开发中心提供；毒素清颗粒（河南中医学院第一附属医院制剂室提供，每g含生药量为1.66g）；双黄连口服液（由河南竹林众生制药股份有限公司提供，批号：0411162）；精制大肠杆菌内毒素（LPS，ColiO111：B4,由美国Sigma公司提供，用时用无热原生理盐水稀释成100μg/ml备用）。MIP2原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。
1.2模型建立与分组给药
1.2.1模型建立
取健康42月龄雄性日本大耳白兔14只，随机分为模型组（n=7）和对照组（n=7）。家兔肺损伤模型组采用一次性耳缘静脉注射LPS60μg/kg,对照组一次性耳缘静脉注射生理盐水60μg/kg，造模后5h取材。采用放射免疫法测定肺泡灌洗液（BALF）中TNFα、sIgA水平；采用黄嘌磷氧化酶法和TBA（硫代巴比妥酸）法分别测定肺泡灌洗液中SOD、MDA的水平；光镜下观察肺组织形态学改变；采用免疫组织化学技术检测肺组织中ICAM1、VCAM1、IL1和TNFα的表达水平。
1.2.2分组给药
36只大耳白兔随机分为6组：空白对照组，模型组，毒素清高剂量组（高剂量组），毒素清中剂量组（中剂量组），毒素清低剂量组（低剂量组），双黄连组。空白对照组和模型组在造模前2d，2h及造模后30min分别灌胃生理盐水。毒素清各剂量组和双黄连组于造模前2d,2h及造模后30min分别灌胃毒素清颗粒（5.04，2.52，1.26g・kg-1・d-1）和双黄连（2.8ml・kg-1・d-1）。
1.3取材与处理
造模后5h，腹部备皮，碘酒和75%酒精消毒，无菌条件下切开腹部皮肤，取末段回肠，一部分用4%多聚甲醛固定2h，流水冲洗1h，置于酒精中待分子生物学测定。
1.4原位杂交法检测MIP2mRNA的表达测定
小肠组织切片用二甲苯15min×3次常规脱腊，然后用梯度酒精处理，3％H2O2/甲醇液室温处理15min，蒸馏水洗涤5min×3次，在切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃恒温孵箱消化18min，用0.5mol/LPBS洗涤5min×3次，蒸馏水洗涤1次。预杂交：每张切片滴加预杂交液20μl，40℃孵育3小时。杂交：在切片上滴加MIP2寡聚核苷酸探针杂交液20μl，加盖原位杂交专用硅化盖玻片，恒温孵箱40℃湿盒杂交过夜。阴性对照不加探针杂交液。杂交后洗涤：去掉盖玻片，37℃水温的2×SSC洗涤5min×2次，0.5×SSC洗涤15min×1次，0.2×SSC洗涤15min×1次。滴加封闭液：37℃孵育30min，甩去多余液体，滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃孵育60min。原位杂交用PBS洗涤5min×4次。滴加SABC：37℃孵育20min。原位杂交用PBS洗涤5min×3次。滴加生物素化过氧化物酶：37℃孵育20min。原位杂交用PBS洗涤5min×4次。DAB显色，苏木素复染，充分水洗。酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。小肠组织MIP2原位分子杂交：MIP2mRNA阳性信号表达显示为棕黄色颗粒，每一张玻片随机选取5个不重叠的视野进行图像分析，400倍光镜下测定MIP2阳性细胞表达的光密度值。取其平均值。
1.5统计学方法
采用SPSS13.0统计分析软件，所有计量资料用x±s表示，采用单因素方差分析。
2结果
2.1家兔肺损伤模型检测结果
与对照组相比，内毒素性肺损伤模型组家兔BALF中TNFα含量明显升高（P＜0.01），而sIgA明显降低，内毒素性肺损伤模型组家兔BALF中SOD活性较空白对照组显著降低，而MDA含量显著升高，肺组织镜下可见炎症呈弥漫状，支气管周围伴有大量炎症细胞浸润，管腔堵塞，肺实变，肺泡隔增宽，肺间质水肿，可见较多白细胞浸润，局限性肺不张，毛细血管扩张充血。模型组肺组织含水量较对照组明显增加，免疫组化结果显示，模型组肺组织中ICAM1、VCAM1、IL1和TNFα的表达水平强阳性，对照组
