森林脑炎纯化疫苗原液制备工艺的研究

森林脑炎纯化疫苗原液制备工艺的研究首席医学网2005年05月18日15:55:37Wednesday中华临床医师杂志征稿内科临床新进展研讨班重症与血流动力学大会血液净化技术学习班医学类核心期刊征稿第六届世界中医药大会2009世界高血压大会第四届中国国际白血病急危重病护理交流会IOF亚洲骨质疏松班2009年中国药学大会医学影像学术交流会结直肠肛门外科会议口腔正畸学术会议征稿广东研究生学术论坛

作者：赵建王晓宏尹兵张双庆孙俊峰刘双军岳立广惠连宋宗明

【关键词】效力试验

　　【摘要】目的研究一种适合森林脑炎纯化疫苗规模化生产工艺的新方法，其特点是生产疫苗的质量符合规程标准、产量高、成本低。方法单层细胞感染病毒培养过程中加入适量小牛血清替代人血白蛋白，可再次换入培养液收获两次疫苗原液。结果两次收获的疫苗原液合并经纯化制成纯化疫苗，各项检测指标均达到规程标准，且疫苗原液收获量比原工艺提高83%。结论新工艺可作为森林脑炎纯化疫苗规模化生产的最佳工艺流程。

　　【关键词】纯化疫苗人血白蛋白效力试验　　Thepreparationfortechnologicalprocessofpurifiedtick-borneencephalitisvaccine　　ZhaoJian，WangXiaohong，YinBing，etal.　　ChangchunInstituteofBiologicalProducts，Changchun130062.　　【Abstract】ObjectiveToprepareanewmethodofproducingthepurifiedtick-borneencephalitisvaccine，itscharacteristicishighoutput，lowproductioncost.MethodsGoodenHamsterKidneycells（GHKC）wereinfectedwithviruscultivationliquidofcontainbovineserum，andchangecultivationliquidonceagain，thencollectitatthesametime.ResultsTheprotectionindexofthepreparedvaccinemettheChineseRequirementsforBiologics.Thevaccineamountofnewmethodaremorethan83%tooldmethod.ConclusionThenewmethodcanberegardedasthebesttechnologicalprocessofproducingthepurified-borneencephalitisvaccine.　　【Keywords】purifiedvaccinehumanserumalbuminpotenciestest　　森林脑炎灭活疫苗（以下称森脑疫苗）原生产工艺病毒感染液含0.1%人血白蛋白，培养3d后收获疫苗病毒原液。原工艺延用了数十年，疫苗质量是稳定的。但生产纯化疫苗［1］要求具备大量的高滴定的疫苗病毒原液。原工艺细胞出现病变快，维持时间短，只能收获一次，这就限制了疫苗病毒原液的产量。为了提高疫苗病毒原液的产量，降低成本，笔者进行了新生产工艺的研究。

　　1材料与方法　　1.1毒种疫苗生产毒株“森张”株，鼠脑传代保存。　　1.2地鼠肾细胞的制备二周龄健康金黄地鼠，无菌取肾，胰酶4℃～8℃消化，制成细胞悬液接种细胞培养瓶，置37℃旋转培养，长成单层后备用。　　1.3疫苗原液的制备将已制备的细胞随机分成两组。第1组采用原生产工艺［2］感染病毒后收获病毒液并抽取病毒滴度样品。第2组采用新工艺，感染维持液含有1%小牛血清，33℃培养3d收获病毒液后，再加入含有1%小牛血清的维持液，33℃培养3d收获病毒液。两次收获的病毒液分别抽取病毒滴度样品。新、旧两种工艺收获的病毒液在抽取病毒滴度样品后均按常规方法（中国生物制品规程，2000）灭活。　　1.4毒力滴定按常规方法（中国生物制品规程，20000）测定，毒力大于7.0LgLD50/ml为合格。　　1.5效力试验制备的疫苗于第0、7d腹腔免疫10～12g小鼠，每次0.3ml/只，设同批小鼠作为对照。于第14d以“森张”株病毒腹腔攻击，0.3ml/只，攻击后21d判定、计算免疫保护力指数，对照组病毒滴度应≥7.5LgLD50/0.3ml。

　　2结果　　2.1两组试验制备的原液比较将两个试验组的病毒液样品分别进行病毒滴定及产量的比较见表1。从表1可见新工艺两次收获的病毒液的病毒滴度与原工艺无差异（P>0.05），且均达到合格标准。表明新工艺不影响病毒液的病毒滴度，且产量得到提高。如按投产100瓶计算，原工艺可收获病毒液300L，按新工艺则可收获550L，增产83%。　　表1两种工艺收获疫苗原液的毒力滴度及产量（略）　　2.2疫苗的纯化及效力检定将新工艺制备的病毒液合并、经超滤浓缩、Sepharose4FF柱层析纯化病毒抗原，柱层析可出现2个峰，经测定第1峰为森林脑炎病毒抗原峰，层析图谱见图1。收集第1峰配制成纯化疫苗，经各项检定结果表明，新工艺生产的3批纯化疫苗免疫保护力指数均大于1.0×105，比森脑灭活疫苗的合格标准高出10倍以上。经柱层析后的牛血清蛋白残留量均低于质控指标50ng/ml见表2。　　图1森林脑炎疫苗Sepharose4FF柱层析图谱（略）

　　表2新工艺生产纯化疫苗的质量检定结果（略）　　注:★单位为ng/ml，※滴度单位为LgLD50/0.3ml，对照组滴度为8.50　　3讨论　　森林脑炎是一种以蜱类为主要传播媒介的自然疫源性传染病，病死率高达20%～30%，急性期症状消失后，常遗留麻痹性后遗症。为预防森林脑炎的爆发和流行，我所自1952年开始研制森脑疫苗，疫苗质量也不断改进提高，但粗制疫苗不能克服抗原含量低，杂蛋白多，注射剂量大，副反应重等缺点。纯化疫苗的研制可克服上述诸多缺点，是较理想的换代产品。　　森脑疫苗的原工艺中要求加入人血白蛋白作为培养保护剂，这是粗制疫苗细胞培养的多年一贯制方法。这种方法的主要缺点是，细胞感染病毒后可引起细胞破坏而严重脱落，细胞维持时间短。针对这一问题，在维持液中加入1%小牛血清可使细胞维持时间显著延长，从而增加了收获次数。同时小牛血清较人血白蛋白更为经济，成本低来源容易，且在纯化过程中可以除去，疫苗中牛血清残存量较低。值得提出，柱层析前病毒原液经过连续流离心以去除病毒原液中的杂质，故在细胞感染后可减少浸泡步骤，从而简化了制备工艺。　　从效力试验结果可以看出，新工艺与原工艺制备的病毒原液的病毒滴度无差异。但新工艺制备的病毒原液量远超过原工艺的产量，而且减少了原料投入，降低了生产成本。故新工艺可作为森脑纯化疫苗规模化生产的最佳工艺流程。　　参考文献　　1宋宗明，韩亮，郭新，等.森林脑炎纯化疫苗的研究.中国生物制品学杂志，2002，15（1）:32-34.　　2宋宗明，颜淑琴，宋泽民，等.森林脑炎病毒地鼠肾细胞培养增殖动态及疫苗生产工艺改进的研究.微生物学免疫学进展，2001，29（2）:34-37.　　（编辑李一）

　　作者单位:130062吉林省长春生物制品研究所

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