潘生丁对呼吸道合胞病毒肺炎治疗作用的实验研究文章来源： 2006-7-2211:24:25
潘生丁对呼吸道合胞病毒肺炎治疗作用的实验研究
中华儿科杂志1998年第6期第36卷论 著
作者：潘家华 楼皖玲 陈兰举 姚敏 李清友
单位：233004蚌埠医学院附属医院儿科（潘家华、陈兰举、李清友）；蚌埠医学院组胚教研室（楼皖玲），病理教研室（姚敏）
关键词：双嘧达莫；呼吸道合胞病毒；肺炎；病毒性
【摘要】 目的 探讨潘生丁（DPM）对呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎的治疗作用。方法 采用光镜、电镜观察肺组织形态等方法，对RSV肺炎组与RSV肺炎+DPM处理组的小鼠进行了对比观察。结果DPM处理组小鼠肺组织病毒滴度明显低于肺炎组（P＜0.01）；RSV肺炎组小鼠肺间质较多淋巴细胞浸润，肺泡隔重度增宽和实变，毛细血管严重瘀血、血小板聚集和血栓形成；巨噬细胞溶酶体少，残余体堆积；DPM处理组小鼠肺间质浸润淋巴细胞少，肺泡隔轻、中度增宽，无实变；毛细血管无瘀血、血小板聚集和血栓形成；巨噬细胞内大量溶酶体，吞噬活跃。结论 DPM能抗RSV肺炎血管内血小板聚集和血栓形成，减少T淋巴细胞增生和浸润，提高巨噬细胞吞噬病毒能力。
Anexperimentalstudyontreatmentofrespiratorysyncytialviruspneumoniainmicewithdipyridamole
PanJiahua,LouWanling,ChenLanj%26uuml;,etal.
AffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu,Anhui,233004
【Abstract】 Objective Toevaluatetheeffectsofdipyridamole（DPM）intreatmentofrespiratorysyncytialvirus（RSV）pneumoniainmice.Methods ThepathologicalchangesofthelungtissueofDPM-treatedanduntreatedgroupsofmice（20ineach）withexperimentallyproducedRSVpneumoniawerecomparativelyobservedunderlightmicroscopeandtransmissionelectronmicroscope.Results ViraltiterinlungtissueremarkablydecreasedinDPM-treatedgroupascomparedwithcontrolgroup（P＜0.01）.Infiltrationofmorelymphocytesinlunginterstitium,severethickeningofalveolarinter-septum,pulmonaryconsolidation,sludgingofblood,plateletaggregationandembolismincapillaries,fewerlysosomesofmacrophagesassociatedwithexcessiveresidualproductswerefoundinthecontrolgroup.SuchchangesweremilderorabsentinDPM-treatedgroup.Conclusion DPMcouldinhibitplateletaggregationandembolism,decreaselymphocyteinfiltrationandimprovephagocytosisfunctionofmacrophagesinRSVpneumoniainmice.
【Keywords】 【Keywords】 Dipyridamole Respiratorysyncytialviruses Pneumonia,viral
我们用潘生丁（Dipyridamole,DPM）治疗婴幼儿呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎，取得良好疗效［1］。我们建立DPM治疗RSV肺炎小鼠模型，通过光镜、电镜等方法连续隔日观察肺组织病理改变，以探讨DPM的治疗作用。
材料和方法
一、材料
1.RSV肺炎动物模型的制备：6～7周龄Balb/c小鼠44只（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），清洁级，健康，雌性，体重15～17克。RSVLong株及Hep-2细胞株均来自上海儿科研究所病毒室。将RSV接种于Hep-2单层细胞，培养细胞病变至（+++）。取40只小鼠经乙醚麻醉，用微量加样器分两次将RSV悬液0.1ml（106PFU）滴入鼻内，制成有组织实变、坏死的小鼠肺炎模型［2］。将肺炎小鼠随机分成（1）肺炎组20只；（2）DPM处理组20只；（3）另4只未处理的小鼠为正常组。将正常组于实验前脱颈椎处死，取左肺、脾，右肺匀浆，-20℃保存。实验前肺炎组、DPM处理组未用任何药物。第二天，DPM处理组用DPM50mg*kg-1*d-1灌胃，肺炎组用重酒石酸100μl灌胃［2］，共用药3天。第5、7、9、12天，两组隔日分别取6、6、4、4只小鼠脱颈椎处死。肉眼观肺组织充血、肿胀，有的可见实变病灶。取左肺、脾，右肺匀浆，-20℃保存。
2.标本处理：（1）将所取左肺组织及脾用4%多聚甲醛PBS液固定、丙酮脱水、石蜡包埋、HE染色后用于光镜检查。（2）将左肺组织用2.5%戌二醛PBS液固定，由上海医科大学电镜室进行包埋用于透射电镜观察。
二、方法
1.光镜标本体视学测量：作左肺横切面连续切片，每隔100μm取切片1张，片厚6μm，共3张。置网格目镜测微尺在400倍镜下，每张切片取10个视野，每视野面积36100μm2，每方格面积1444μm2，计数切片上肺泡炎0～Ⅳ级方格数，数据取3张切片的均数。参照Szapiel［3］提供的肺泡炎分级，0～Ⅳ级病变确定如下：0级 无肺泡炎；Ⅰ级 肺泡壁间质水肿，毛细血管充血致肺泡壁轻度增厚；Ⅱ级肺泡壁中度增厚，肺泡腔变小；Ⅲ级 肺泡壁重度增厚，肺泡腔狭小或膨大；Ⅳ级 肺实变。
2.病毒斑形成试验：参照文献［4］。两组共4批，每批4只小鼠。将右肺组织匀浆以1∶10进行稀释，稀释后的匀浆液-20℃保存。预先用96孔培养板培养Hep-2单层细胞。将10μl稀释后的匀浆液再经10倍稀释后加入培养板孔中，每孔加10μl，每只动物3个重复孔，设阴性对照、正常对照。37℃，5%CO2条件下，间歇振摇培养板，1小时后，用RPMI1640液洗涤，覆以1%甲基纤维素。置37℃，5%CO2培养6天。培养孔内用0.2%福尔马林固定，0.1%结晶紫染色，计数斑个数。病毒滴度以每克新鲜组织斑形成单位（PFU/g）计算。
三、统计学处理
肺泡炎中位网格面积以构成比分析；两组病毒斑形成情况比较用t检验。
一、肺组织光镜检查与体视学测量结果（附表）
肺炎组、DPM处理两组感染后均有不同等级的肺泡炎形成。肺炎组感染后5天，Ⅲ级以上炎症占总炎症面积约66%，以后逐渐减轻，12天后已无Ⅲ级以上炎症，但仍以Ⅱ级炎症为主；DPM处理组未见Ⅳ级炎症，感染7天后即无Ⅲ级以上炎症，9天后以Ⅰ级炎症为主，与同期肺炎组相比炎症均轻。肺炎组细支气管以下呼吸道和血管间质淋巴细胞浸润，以感染第7天为最严重，以后逐渐减少。DPM处理组肺间质浸润淋巴细胞出现少而迟缓，于第12天小气道周间质浸润淋巴细胞增多。
二、肺组织电镜检查结果
正常组：肺泡Ⅰ型细胞扁薄，胞质中有线粒体等细胞器和吞饮小泡；Ⅱ型细胞胞质中细胞器丰富，板层颗粒较致密。
肺炎组：感染第5～7天，Ⅰ型细胞线粒体消失，吞饮小泡大量增加，表面见病毒芽生形成200～400nm长短不等的柱状体（图1）。释放于细胞外的成熟病毒颗粒，直径100～280nm，内有螺旋状盘绕核衣壳，包膜厚，纤突明显。Ⅱ型细胞线粒体肿大或消失，内质网扩张，板层颗粒结构松散。肺泡腔有细胞碎片、纤维素及蛋白渗出液。肺泡区有淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞浸润与渗出，可见杀伤性T淋巴细胞破坏邻近感染细胞。巨噬细胞体小，胞质中溶酶体少，毛细血管内皮肿胀，表面伸出不规则棘突，腔内严重瘀血，有微血栓形成。第9～12天，Ⅰ型细胞内仍有较多吞饮泡，Ⅱ型细胞仍肿胀。毛细血管轻度瘀血，腔中常见血小板滞留、聚集和脱颗粒。巨噬细胞内堆积大量吞噬物和残余体，呈不能销毁状。肺炎组小鼠坏死的Ⅰ型细胞表面质膜破损，边界模糊或间断变厚，内有电子致密物附着，可见病毒芽生的柱状体，细胞内有病毒囊膜及核衣壳（图内标尺示200nm）
图1 RSV感染7天时肺炎组小鼠肺组织电镜图dPM处理组肺泡上皮肿胀较轻，Ⅱ型细胞内线粒体膜及嵴多完整，Ⅰ型细胞胞质内大量吞饮小泡，线粒体结构基本完整（图内标尺示500nm）图2 RSV感染7天时DPM处理组小鼠肺组织电镜图附表 两组RSV肺炎的肺泡炎面积及病毒斑形成试验感染时间
及组别动物 数肺泡炎中位网格面积（μm2）各级肺炎面积构成比（%）病毒滴度 PFU/g）细支气管周淋巴细胞
浸润ⅣⅢⅡⅠ0合计ⅣⅢⅡⅠ0感染后5天 肺炎组6288819855.010830902.5034475.58.3857.5931.412.6205.0±0.7++ DPM组603610.01714012635.0033385.0010.8151.3437.8503.0±0.8-感染后7天 肺炎组609198.3216600030858.3029.8170.19004.7±0.7+++ DPM组600 216609920.0031580.00068.5931.4102.6±0.5+感染后9天 肺炎组404505.3315800036085.3012.4987.51003.8±1.0+ DPM组400 1624519855.0036100.00045.0055.0002.1±1.4+感染后12天 肺炎组400 261659920.0036085.00072.5127.4903.1±0.8+ DPM组400 1172524360.0036085.0 0032.4967.5101.2±1.4++注：两组病毒滴度在感染5及7天，差异均有非常显著意义，t分别为4.48和6.77，P均＜0.01，9天后虽仍DPM组低于肺炎组，但由于例数较少，差异均未达显著界值，t分别为2.05和2.38，P略＞0.05 DPM处理组：第5～7天，肺泡上皮细胞肿胀，但线粒体膜及嵴多完整，内质网轻度扩张（图2）。可见病毒芽生的柱状体和细胞外病毒颗粒。毛细血管扩张，腔中无红细胞、血小板聚集和血栓形成。肺泡腔内渗出液少。巨噬细胞胞体大，含有大量溶酶体、核周滑面内质网和分泌泡，质膜下很多吞饮泡和吞噬的表面活性物质。第9天，肺泡上皮细胞大多结构正常，少数Ⅱ型细胞线粒体肿胀。第12天，肺泡上皮与毛细血管超微结构正常，巨噬细胞胞质丰富，质膜下仍有活跃吞噬和吞饮现象。
三、脾脏组织学改变
肺炎组：第5天，脾动脉周淋巴鞘扩大，连成一片，淋巴母细胞多。第7～12天，白髓轻度增生，淋巴母细胞逐渐减少。
DPM处理组：第5～7天，脾白髓未扩大，多孤立成团，其中主要为小淋巴细胞，淋巴母细胞少。第9～12天，动脉周淋巴鞘轻度扩大和增生，淋巴母细胞较多。
四、病毒斑形成试验
第5～7天，DPM处理组比肺炎组病毒滴度明显降低，差异有非常显著意义（t值分别为4.48和6.77，P＜0.01）。第9～12天，DPM处理组病毒滴度低于肺炎组，但差异无显著意义。在第12天，肺炎组每鼠均有病毒融合斑形成，而DPM处理组有50%小鼠无病毒融合斑形成（附表）。
一、DPM对肺微循环的作用
RSV肺炎感染严重期，肺泡炎区出现血浆渗出、瘀血和微血栓形成等。在病毒、缺血、缺氧等因素共同作用下，肺泡上皮严重变性坏死。感染恢复期，微血管内仍有红细胞和血小板凝集，肺泡结构修复缓慢。巨噬细胞所出现的吞噬、消化能力低下也与微循环障碍有关，病毒滴度始终处于较高水平。DPM抗红细胞、血小板凝集和抗血栓形成，保持微循环畅通，因此能减少血浆渗出，减轻肺泡上皮肿胀和坏死，肺泡结构较早恢复，与此同时，巨噬细胞超微结构发育良好，对细胞内大量吞噬物显示出充分消毁能力。感染第5～7天，DPM处理组病毒滴度明显低于肺炎组，提示巨噬细胞在微循环障碍改善条件下分泌大量干扰素灭活病毒。
二、DPM对细胞免疫反应的作用
RSV肺炎第5天病毒滴度最高，第7天间质淋巴细胞浸润最多。有研究表明，浸润T淋巴细胞主要是CD4与CD8二亚群，尤CD+8淋巴细胞可引起肺泡严重病理改变［5］。我们观察到感染第7天出现杀伤性T淋巴细胞，使靶细胞崩解为细胞碎片，引起病毒扩散和肺泡壁破损，加重血浆渗漏。DPM能减少脾动脉周淋巴鞘杀伤性T淋巴细胞增生和肺杀伤性T淋巴细胞浸润，所以DPM处理组肺泡炎区坏死和崩解的细胞少，病理改变较轻。
DPM减少杀伤性T淋巴细胞增生和减轻肺微血管损伤的作用可能与腺苷功效相关。DPM是腺苷转运抑制剂，可增加细胞外腺苷浓度。腺苷能抑制淋巴细胞增生反应［6］、抑制单核细胞分泌肿瘤坏死因子［7］、阻止肺毛细血管通透性增加［8］。DPM可能是通过腺苷的作用机制减轻肺泡炎症
1 潘家华，周汉昭，严淑芳.潘生丁治疗婴幼儿呼吸道合胞病毒肺炎临床疗效初步研究.湖南医科大学学报，1990，15：375-377.
2 楼皖玲，潘家华，陈兰举，等.潘生丁在呼吸道合胞病毒肺炎中的细胞免疫抑制作用.中华实验和临床病毒学杂志，1996，10：235.
3 SzapielSV,ElsonNA,FulmerTD,etal.Bleomycin-inducedinterstitialpulmonarydiseaseintheNude,Athymicmouse.AmRevRespirDis,1979,120:893-899.
4 PrinceGA,JensonAB,HorswoodRL,etal.Thepathogenesisofrespiratorysyncytialvirusinfectionincottenrats.AmJpathology,1978,93:771-783.
5 GrahamBS,BuntonLA,WrightPF,etal.RoleofJlymphocytesubsetsinthepathogenesisofprimaryinfectionandrechallengewithrespiratorysyncytialvirusinmice.JChinInvest,1991,88:1026-1033.
6 冯龚熙，刘发，胡坚，等.腺苷对细胞免疫功能的影响.中国药理学通报，1994，10：424-428.
7 LeMoineO,StordeurP,SchandeneL,etal.AdenisineenhancesIL-10secretionbyhumanmonocytes.JImmunol,1996,156:4408-4414.
8 AdkinsWK,BarnardJW,MooreTM,etal.AdenosinepreventsPMA-inducedLunginjuryviaanA2receptormechanism.JApplPhysiol,1993,74:982-988.
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