酶联免疫测定法在肝吸虫病诊断的应用

酶联免疫测定法在肝吸虫病诊断的应用首席医学网2005年03月06日09:57:39Sunday中华临床医师杂志征稿内科临床新进展研讨班重症与血流动力学大会血液净化技术学习班医学类核心期刊征稿第六届世界中医药大会2009世界高血压大会第四届中国国际白血病急危重病护理交流会IOF亚洲骨质疏松班2009年中国药学大会医学影像学术交流会结直肠肛门外科会议口腔正畸学术会议征稿广东研究生学术论坛

作者：李穗芬谭奕洲陈伟烈

【关键词】酶联

【摘要】目的探讨一种简便、敏感、特异的肝吸虫检验方法。方法以成虫粗蛋白为抗原，用ELISA方法检测肝吸虫病患者血清中的肝吸虫抗体。肝吸虫病患者均为大便检出虫卵。设健康人及其他疾病患者作对照。结果肝吸虫病患者血清31例，本法阳性30例;其他疾病患者血清102例，本法阳性10例;健康人血清65例，本法阳性5例。本法敏感性为96.8%，特异性为93.1%;诊断准确度为93.1%。结论本法敏感性高，操作比较简便，可作为肝吸虫病的初诊及普查筛选方法。

关键词肝吸虫酶联免疫吸附实验

ApplicationofELISAinthediagnosisofhepaticdistomiasis

LiSuifen，TanYizhou，ChenWeilie

GuangzhouEighthPeople'sHospital，Guangzhou510060.

【Abstract】ObjectiveTodiscussaconvenient，sensitiveandspecifictesttechniquetodetecthepaticdisto-miasis.MethodsTheantibodyofhepaticdistomiasisintheserumofclonorchiasissinensispatientswasdetectedwithantigenofdistomiasisimagocoarseproteinbyELISA.Wormeggsofdistomiasisweredetectedinthestoolofeveryclonorchiasissinensispatients.Sethealthypeopleandpatientswithotherdiseasesasnormalcontrols.ResultsTheantibodyofhepaticdistomiasiswasdetectedin30outof31serumsofclonorchiasissinensispatientsbyELISA.10/102ofpatientswithotherdiseasesweredetectedtheantibodyinserum.And5/65ofhealthypeople'santibodyofhepaticdistomiasisinserumwerepositive.ThesensitivityofELISAtodetectthehepaticdistomiasiswas96.8%，thespecificitywas93.1%，andthecorrectrateofdiagnosiswas93.9%.ConclusionThesensitivityofELISAtodetectthehepaticdistomiasisishigh，andtheoperationissimple，ELISAcouldbeusedasonemeanstofirstdiagnoseandnormalcheckthediseaseofclonorchiasissinensis.

Keywordshepaticdistomiasisenzymelinkedimmunoadsorbedassay

华支睾吸虫病是由于华支睾吸虫寄生在肝内胆管所引起的一种疾病，故又称其为肝吸虫，可引起严重的肝脏损害，是由于患者进食感染了华支睾吸虫囊蚴而未煮熟的淡水鱼、虾所致。肝吸虫病流行于东南亚地区，在我国有24个省、市、自治区有不同程度的流行，人群感染率为1%～30%［1］，其中广东省流行最为严重，平均感染率16.2%［2］。由于肝吸虫病的症状和体征缺乏特异性，加之近年流动人口增加，以及火锅、烧烤等饮食方式的兴起，可使人群的患病机会增多，给诊断带来一定的困难。本病的诊断目前主要依靠粪便检出虫卵，然而粪便检查虫卵的阳性率不高，轻度感染者容易漏诊。因此，期待寻找敏感性和特异性高而且操作简便的新方法。我们应用酶联免疫测定法检测患者血清中的肝吸虫抗体，现报告如下。

1材料与方法

1.1.1试剂及试剂盒由深圳绿瀚生物技术有限公司提供。该试剂盒所含试剂包括:已包被抗原的聚苯乙烯条孔，包被的抗原浓度为8μg/ml（蛋白量），每孔100μl。试剂溶液6瓶，1号液为酶结合物（SPA-HRP），2号液为洗涤液，3号液为底物（TMB），4号液为显色剂，5号液为血清稀释液，6号液为反应终止液。

1.1.2参考血清阳性参考血清和阴性参考血清各1支。1.1.3待测血清198例血清均来自本院患者及健康体检者，其中肝吸虫病患者31例（粪便检出肝吸虫卵），其中25例患者嗜酸性粒细胞计数升高，18例患者有不同程度的消化系统症状，如消化不良、食欲不振，反复出现右上腹部及剑突下疼痛等，12例出现间歇性黄疸;其他疾病患者102例（3次粪便检查阴性）;健康对照65例。

1.2.1加样每孔加血清稀释液（5号液）2滴，立即加入待检血清10μl，并设阴性、阳性、空白对照，室温反应10min，甩去，拍干。

1.2.2反应加酶结合物（SPA-HRP）（1号液）2滴，室温反应10min，甩去，加洗涤液（2号液）1滴，立即用蒸馏水反复洗涤5次，甩去，拍干。

1.2.3显色加底物（TMB）（3号液）和显色剂（4号液）各1滴，室温下放置2～3min，待阴性对照孔呈微蓝色时，加反应终止液（6号液）1滴，混匀，终止反应。

1.2.4结果判断用酶标仪630nm测定OD值。待检血清孔OD值与阴性对照孔OD值之比>2.1判为阳性。也可用肉眼观察结果，“-”:颜色浅于阴性对照或与阴性对照一致。“±”:颜色深于阴性对照，浅于阳性对照。“+”:颜色近似于或深于阳性对照。

肝吸虫患者血清31例，本法阳性30例，阳性率96.8%;其他疾病患者血清102例，本法阳性10例，假阳性9.8%。结果见表1。根据表1数据统计，本试验敏感性为96.8%，特异性为93.1%，诊断准确度为93.1%。

表1各组检测结果（略）

华支睾吸虫的成虫寄生于人或哺乳动物的胆管内，在胆管内产卵，虫卵随胆汁进入消化道混和在粪便中排出体外，虫卵产出后便已成熟，里面含有毛蚴，一般情况下不能孵化，只有当虫卵进入水中，并被适宜的第一中间宿主螺蛳吞食后，在螺蛳的消化道中才能孵化出毛蚴，并逐渐发育成尾蚴。尾蚴从螺体逸出后，在水中游动，碰到适宜的第二中间宿主―淡水鱼（或虾），则附着并侵入鱼体的各个部分，尤其是肌肉，并逐渐发育成囊蚴。囊蚴必须进入人或哺乳动物（猫、狗、猪、鼠等）体内才能发育为成虫。当鱼或虾体中囊蚴被人或上述动物吞食后，经胃、肠道消化液的作用，幼虫在十二指肠穿破囊壁而出，并从十二指肠循总胆管经胆道进入肝胆管，在肝胆管发育为成虫，并开始产卵。目前肝吸虫病的诊断主要依靠粪便检出虫卵。由于肝吸虫卵体积小，粪便直接涂片检查很容易漏诊，尤其轻度感染者检出率更低。河南医学院寄生虫学教研室曾用沉淀法检查33例本病患者粪便，1次粪便送检的阳性率只有51.5%，2次粪便送检的阳性率是75.7%，个别病例在第8次粪便送检时才检出虫卵。十二指肠液及胆汁的检出率比粪便的检出率高，但该法标本采集不方便，患者不易接受，故不常用。从理论上说，检测患者血清肝吸虫抗原是一种较好的方法，能够判断现症感染，是替代粪便检查虫卵的理想方法。但该法在技术上存在一定困难，目前未能广泛应用。杜文平等［3］用成虫可溶性抗原进行斑点免疫金银染色法检测肝吸虫病患者、健康人和日本血吸虫病患者血清，符合率均为98.0%，假阳性率均为2.0%。与日本血吸虫患者血清无交叉反应。按杜文平的报道，斑点免疫金银法敏感性比较高，特异性比较强，但是此后10年来未见再有类似文献报道。曾明安等［4］成功研制快速ELISA试剂盒，用于检测肝吸虫抗体。但该法试剂需临用前稀释，稀释后的酶结合物不稳定，而且操作时间较长。本法采用成虫粗蛋白抗原检测肝吸虫特异抗体，具有敏感性高，操作简便、快捷等优点。本组试验结果显示，本法敏感性为96.8%，特异性为93.1%，诊断准确度为93.1%。本试验敏感性高、操作简便，对肝吸虫病的普查筛选有较大的应用价值。本试验特异性尚可，因而对肝吸虫病的初步诊断也有一定价值。在肝吸虫病组的31例中，有1例本试验阳性，但3次粪便都查不到虫卵。后做十二指肠引流，查出肝吸虫卵，该病例在第5次粪便检查时才发现少量虫卵。另有5例患者本试验阳性，但2～3次粪便涂片都查不到虫卵，后做1～2次粪便沉淀集卵法才发现肝吸虫卵。华支睾吸虫病的防治应该做好下列工作:（1）抓住经口传染这个环节，做好宣传教育工作，提高人们对该病传播途径的认识，自觉不吃生的或不熟的鱼或虾，这是预防措施的主要环节。改进烹调方法和改变饮食习惯，注意将切生、熟食物的菜刀、砧板及器皿分开使用，以防吃进活囊蚴。（2）及早发现并积极治疗患者和感染者，以减少传染源。（3）合理处理粪便，研究改变养鱼的饲料和厕所盖在鱼塘上的习惯，以免粪便污染鱼塘。这些都是预防华支睾吸虫病传播的重要措施。

1陈佩惠.人体寄生虫学，第4版.北京:人民卫生出版社，1997，88-92.

2广东省寄生虫病防治研究所.广东省寄生虫病防治工作进展情况.中国寄生虫病防治杂志，1992，3（2）:231-234.

3杜文平.快速斑点免疫金银染色方法诊断华支睾吸虫病的观察.中国人兽共患病杂志，1991，7（4）:13-14.

4曾明安.诊断华支睾吸虫病的Fast-Dot-ELISA试剂盒的建立及应用.实用寄生虫病杂志，1993，1（10）:35-38.

（编辑文静）

作者单位:510060广东省广州市第八人民医院

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