建立阿尔茨海默症的转基因动物模型
解剖学报2000年第2期第0卷论著
作者：常洋秦川尹红星朱华蔡有余
单位：常洋秦川尹红星朱华蔡有余（中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所，北京100021）
关键词：阿尔茨海默症；app；转基因；模型
【摘要】目的建立阿尔茨海默症转基因动物模型，为病因研究和药物筛选提供了一个合适的动物模型。方法通过显微注射方法将外源dna注射到小鼠受精卵的雄性原核，移植到假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生后，经pcr及pcr-southern杂交检测阳性小鼠。结果共注射887枚受精卵，存活482枚，移卵后产仔35只，阳性3只。阳性鼠分别传代，在f2代获得纯合子后建系。免疫组织化学显示在大脑皮层、小脑及海马的神经细胞有aβ沉淀形成。结论通过显微注射的方法已建立与人类发病机理相似的阿尔茨海默症转基因动物模型。
【中图分类号】q75【文献标识码】a
【文章编号】0529-1356(2000)02-144
establishmentofthetransgenicmodelof
alzheimerdisease
changyang,qinchuan,yinhong-xing,zhuhua,caiyou-yu
(instituteoflaboratoryanimalscience,chineseacademyofmedicalsciences,
beijing100021,china)
【abstract】objectivetoestablishatransgenicmodelofalzheimerdisease.methodsweconstructedthetransgenecontainingthehumanappcdna695v717idrivenbypdgfpromoterwhichexpressesspecificallyinnervoussystem.thetransgenewasmicroinjectedintothemalepronucleusofthezygotes.thetaildnaofpupswastestedbypcrandsouthernblot.results887embryosweremicroinjected,482wereimplantedto20recipientpseudopregnantmice,3of35pupscarryingthetransgene.eachheterozygousfoundersgeneratedatransgeniclinethatwashomozygousforthetransgene.immunocytochemistryrevealedplaquesinpallium,cerebellum,andhippocampus.conclusionsresemblinganimalmodelofthehumanpathogenicmechanismforthescreeningofproperremediesestablishedinourlaboratoryandcouldbeusedforfurtherstudied.
【keywords】alzheimerdisease;app;transgene;model
阿尔茨海默症(alzheimerdisease,ad)是进行性神经降解性疾病，通常表现为记忆丧失。其基本病理表现是由于app在脑部的异常代谢产生的38～42个氨基酸的有神经毒性的多肽(aβ,β／a4)沉积在大脑皮层和海马结构，形成β-淀粉样斑块［1］。动物模型的缺少已经成为ad发病机理研究及药物筛选的主要障碍。虽然化学方法，免疫方法甚至将多肽直接注入啮齿类动物脑内的努力都已尝试，但都不是很理想［2］。1980年cordon等［3，4］以玻璃针刺进受精卵的雄原核，注入dna溶液，成功地获得转基因动物。利用转基因技术复制人类疾病动物模型，已成为一个主要发展方向。
我们以pdgf启动子调控appcdna构建转基因，通过显微注射进入小鼠受精卵的雄性原核。通过pcr及southern杂交检测获得阳性小鼠，现在正在传代建系。
材料和方法
1.转基因片段的制备
含有全长突变的人appcdna695v717i受控于pdgf启动子调控的质粒ppdap695由本课题组构建［5］。质粒ppdap695的tth111i+xbai的酶切片段为4.1kb，透析袋法进行回收。氯化铯超离纯化，于20℃、40000r/min离心48h。分步收集，将含有dna的溶液合并，在注射缓冲液中透析。注射缓冲液含7.5mmol/ltris(ph7.4)与0.175mmol/ledta。
2.转基因操作
2.1限制性内切酶及主要生化试剂：限制性内切酶及tapdna聚合酶购于promega公司及华美生物工程公司。一般化学试剂均为国产分析纯。乳酸钠、透明质酸酶、矿物油、bsa等均购于sigma公司(embryotested)。孕马血清(pms)购于天津市华孚高新生物技术公司，人绒毛膜促性腺激素(hcg)为上海生物化学制药厂生产。
2.2动物品系：种公鼠为bdf1，10周龄以上。供卵鼠为km，4～5周龄，体重12～16g。结扎公鼠为km／icr，10周龄以上。受体鼠(假孕鼠)为km／icr,8周龄以上，体重30g以上。
2.3主要仪器：倒置显微镜(nikon)、显微操作系统(narishige)、解剖镜(nikon)钟表镊(swiss)、co2孵箱、dna合成仪(pe480)。
2.4超排卵和取卵：供卵鼠于明暗循环的明循环中点腹腔注射pms10iu,46h后注射hcg10iu，并与公鼠合笼，次日晨将有阴栓的母鼠处死。取输卵管在膨大部划出卵团，加透明质酸酶消化，挑出受精卵于m16继续培养4h。
2.5显微注射gd-1管在水平拉针仪(modelpn-30,narishigejapan)拉成注射针。拉针条件：heaterlevel：70.4，magnetsub：22.1，magnetmain：59.6。注射针末端虹吸dna溶液后，于400倍镜下注入受精卵雄性原核。注射浓度2mg/l。
2.6移卵：受精卵注射后在m16继续培养2～4h，挑选生长状态较好的卵，进行移卵。每只假孕鼠输卵管单侧移卵约30枚。
3.转基因鼠的鉴定及传代建系
3.1提取鼠尾dna：仔鼠乙醚麻醉后，剪1.0～1.5cm鼠尾，在裂解溶中剪碎后，加蛋白酶k消化过夜。酚、氯仿抽提，乙醇沉淀、漂洗，晾干后加150μlte溶解。
3.2鼠尾dna的pcr检测：取1～2μl鼠尾dna进行pcr反应。本实验共设计两对引物，分别位于转基因片段的5’端和3’端(图1)。
1app695转基因构建及pcr引物设计图
fig.1constructionofapp695transgeneanddesignofpcrprimers
p1为5’-gtcacccctagttcttttt-3',p25'-ggtagacttcttggcaatac-3',pcr循环：94℃5min预变性；94℃1min,57℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延长10min。
p3为5’-ggtgggcggtgttgtcat-3',p4为5’-acctccccctgaacctgaaa-3’，pcr循环：94℃5min预变性；94℃30s，57℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延长10min。
3.3pcr-southernp3、p4引物对扩增产物选用dig高效随机引物标记与检测试剂盒i(b.m.)进一步检测。
3.4转基因鼠建系首建鼠与c57bl交配，产生f1代。f1代阳性鼠同窝互交，在f2代检测纯合子。
4.病理学检查
标本经4%中性甲醛固定，常规石蜡切片，免疫组织化学采用abc法。abc试剂盒为vector公司产品，一抗为小鼠抗人aβ单克隆抗体，1∶200倍稀释。
结果
1.回收的转基因片段凝胶电泳(图2)
2app695转基因片段电泳图
fig.2gelelectrophoresisofapp695transgene1%agrose
1,λdna／hindiiimarker
2，app695transgene
2.共注射887枚卵，2～4h后存活482枚，植入20只假孕鼠，8只妊娠，共产仔35只，阳性3只，阳性率8.6%(3／35)。
3.为提高pcr的特异性，我们将引物分别设计在来自不同基因的片段中。同时参考app基因组约180kb，含有18个外显子［6］，将p1设计在pdgf启动子的3’端［7］，p2设计在appcdna的5’端第2外显子与第3外显子连接处。pcr扩增产物574bp，中间含有单一hindiii酶切位点可对扩增产物进一步鉴定。p3、p4亦分别设计在appcdna的3’端第17外显子和sv40的5’端，含单酶切位点bamhi。pcr鉴定结果如图3。
图3pcr筛选电泳结果
fig.3identificationoftaildnabypcr,1.2%agrose
3aprimerp1、p23bprimerp3、p4
1，positivecontrol1,positivecontrol
2，negativecontrol,2，negativecontrol
3，tg40＃,4,tg46＃,5,gt47＃，3，tg40＃,4,tg46＃,5,tg47＃,
6，pcrmarker1543，994，694，6,pcrmarker1543,994,694,
515,377,237bp515，377，237bp
4pcr初步筛选出的40＃、46＃、47＃阳性鼠，经进一步pcr-southern杂交检测确定为首建鼠(图4)。3只首建鼠分别和c57bl雌性正常鼠交配，进行传代建系。tg40＃,tg46＃,tg47＃f1代的阳性率分别为24.0%(6／25)，42.9%(12／28)，7.1%(2／28)
4pcr-southern杂交结果
fig.4pcr-southernresult.
1,tg40＃;2,tg46#;3，tg47＃
5.免疫组织化学检查结果，在转基因阳性鼠的大脑皮层、小脑及海马区神经细胞有aβ产生，免疫组织化学显示神经细胞胞浆及间质呈黄棕色染色(图5)。对照鼠免疫组织化学染色呈阴性。
图5app695转基因鼠脑神经细胞胞浆及间质呈黄棕色，abc法×400
6对照鼠脑神经细胞胞浆及间质呈阴性，abc法×400
fig.5immunocytochemistryanalysisoftheapp695transgenicmice,abc×400.thebrainof3-mouth-oldtransgenicmicewereimmunostainedwithaβantibodies.
fig.6immunocytochemistryanalysisofthenon-transgenicmice,abc×400.thebrainof3-mouth-oldnon-transgenicmicewerenotimmunostainedwithaβantibodies.
讨论
1980年cordon等［7］以玻璃针刺进受精卵的雄原核，注入dna溶液，成功地获得转基因动物。利用转基因技术复制人类疾病动物模型，已成为一个主要发展方向。
研究表明，直接表达app基因的aβ片段或c99-104片段以产生ad表型，可能不是一个适当的策略［8］。而app基因组长达170kb，转基因操作难度较大。已在病人脑部发现app各剪接单体表达比例的异常，推测app基因的异常表达与ad发病有关。在m17成纤维细胞瘤细胞中发现v717i突变可增加aβ(1～42)与aβ(1～40)的比例，而前者正是选择沉淀在斑块核心的主要成分，证明这些突变是致病性的。pdgf启动子具有神经组织特异性，调控目的基因在转基因鼠的大脑皮层、海马、下丘脑、小脑广泛表达，与ad的病变部位一致。因此，我们选择pdgf启动子调控全长突变appcdna。
显微注射技术操作复杂，所需仪器昂贵。受精卵最终发育成个体的比例远低于未经显微注射的受精卵，这是由于体外操作、注射造成的物理损伤及dna溶液的化学损伤。同时，移卵手术对动物也是一种损伤。我们在操作过程中所有条件的优化都是将这些损害减低到最小程度，我们在实验中总结一些经验。
采集受精卵的数量及质量很重要，受很多因素的影响。3周龄雌鼠对激素非常敏感，超排卵数量多，但卵膜脆性大，易碎。5周龄以上鼠，超排卵数量减少，但卵较成熟，卵膜有韧性。我们一般选择4～5周鼠作供体。pms的用量为7～10iu／只，hcg的用量为5～7iu／只。pms的质量及纯度很关键。过多的杂蛋白会影响吸收。我们观察，pms的用量在10iu以内时，超排卵的数量与剂量成正比，超过10iu卵的数量增加并不明显，但质量下降，很可能是过量的激素，对卵巢及动物体产生损害，或影响正常生理代谢。hcg的用量在5iu时，一般就能保证超排成功。关键是控制采卵时间与注射hcg间隔20h，此时受精卵正好停留在输卵管的膨大部。任何人工的培养，都难以模拟母鼠体内的最佳条件。所以，应尽量减少受精卵在体外的培养时间，特别是显微操作的时间。注射完成后，尽早移回母鼠体内。注射针拉制后，不经磨针仪处理直接使用，保证尖端的锐利、平滑。注射针始终保持一定压力，进针后不再调整压力。观察到原核膨大后，迅速退针。
外源dna注射到受精卵的雄性原核。小鼠的雄性原核较雌性原核大，易于显微操作。注射后的受精卵，培养2h后，即开始移卵。选择km或icr作假孕鼠的优点是，发情周期稳定，母性强。同时，在颜色上易与仔鼠区分。8周龄时，雌鼠各脏器发育完全成熟，适于作假孕鼠。体重在27～32g时最好，过大则卵巢上的脂肪垫肥厚，不利于移卵操作。考虑到双侧移卵手术操作时间长，对动物损害大。我们采用单侧移卵约30枚。通过观察，我们发现单侧移卵鼠，最终妊娠仍是双侧。说明，受精卵可以被移动到双角子宫的另一侧着床，虽然具体的机制还不清楚。
经pcr筛选出的40＃、46＃和47＃阳性鼠再经southern杂交鉴定，未发现有假阳性。早期的转基因研究中，一直将southern杂交作为阳性鼠的最终结论。实践证明，通过严谨、合理的设计，pcr鉴定完全可以作为最终结论。
3只阳性鼠已分别建系，现已传到f2代。理论上，f1代的阳性率应为50%，但由于转基因随机整合到小鼠的基因组，外源基因的插入可能会影响一些的基因的表达与调控，扰乱了进化过程中形成的稳定、平衡、优化的内环境。所以转基因动物普遍表现为繁殖能力低，抗病能力差。这一点对需要保种、育种的转基因动物尤其重要。tg46＃f1代的阳性率接近50%，但tg47＃仅为7.1%，很可能阳性动物在胚胎发育的早期就受到了影响。f2代纯合子的鉴定工作，正在进行中。
转基因技术在医学研究中的应用，主要是建立与人类发病机理相似的疾病模型。阿尔茨海默症转基因动物模型的建立为研究app的代谢、ad的发生和发展及药物干预对发病进程的影响提供了极好的动物模型。
感谢中国医学科学院基础所李铁昌、郭志晨，中国农业科学院畜牧所陈英在转基因技术上提供的帮助。
【基金项目】国家科技部特别资助项目
作者简介：常洋(1969—)，男(汉族)，黑龙江省哈尔滨市人，博士
参考文献
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【收稿日期】1999-06-08
【修稿日期】1999-10-18
（责任编辑：jbwq）
