医学论文,多发梗塞性痴呆(MID)动物模型的改进与应用

多发梗塞性痴呆（MID）动物模型的改进与应用

中风与神经疾病杂志1999年第2期第16卷论著与经验总结

作者：梅建勋　张云岭　张伯礼

单位：梅建勋　张伯礼　300193　天津中医学院；张云岭　北京中医药大学

关键词：多发梗塞性痴呆；大鼠模型；学习记忆

　　摘　要　目的　为摸索一种操作性较强的多发梗塞性痴呆（MID）模型和观察一种治疗MID有较好临床疗效的中药复方制剂的作用机理。方法　从颈外动脉逆行插管注入同种血栓栓子造成大鼠多发梗塞性痴呆，应用行为学和病理形态学进行观察。结果　造模后脑内存在广泛而多发的梗塞灶，且无论学习成绩还是记忆成绩，手术造模组均明显低于空白对照组和假手术组（P＜0.01或0.05）,采用中药“健脑益智冲剂”和氢化麦角碱（Dihydroergotoxine）药物干预后，上述病变得以明显改善，尤以造模药给予中药最佳。结论　此模型是进行多发梗塞性痴呆基础研究和筛选新药的理想模型。

　　多发梗塞性痴呆（multi-infarctdementia,MID）与老年性痴呆（Alzheimer，sdementia,AD）是60岁以上老年人痴呆的最主要类型，其中MID的发病率尚有不断增高的趋势。本实验参考Kaneko与陈氏方法加以改进制作MID动物模型，并应用中药和西药对其进行药物干预，报告如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　动物分组　一级Wistar大鼠，10月龄，体重320±40g，雌雄各半，由天津医学实验动物中心提供。随机分为空白对照组、假手术组、手术造模组、术前中药组、术后中药组和术后西药组，行为学检查组，每组各20只；病理形态学检查者，各组分别为5只、5只、10只、10只、10只、10只。

　　1.2　动物模型制作　同种Wistar大鼠左心室内采血，于37℃温箱内干燥，研碎后用200μm筛孔过筛，应用时取血栓栓子1mg加生理盐水0.3ml，摇匀成混悬液。10%水化氯醛按35mg/100g体重腹腔麻醉，颈正中切开皮肤，剥离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌与胸骨乳突肌，暴露颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉，暂时夹闭颈总动脉，于颈外动脉逆行插管注入栓子溶液0.3ml，推注同时开放颈总动脉，使栓子通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉，造成多发性脑梗塞，然后结扎颈外动脉，缝合皮肤。

　　1.3　实验仪器　大鼠跳台、避暗箱及Y型水迷宫，日立H-600透射电子显微镜。

　　1.4　处理方法　（1）药物　中药：健脑益智冲剂，主要成分为炙黄芪、制何首乌、川芎、女贞子、石菖蒲、葛根等。西药：氢化麦角碱（Dihydroergotoxine，商品名喜得镇，Hydergine）,由天津华津制药厂与瑞士山德士制药公司合资生产。（2）给药方法　空白对照组：正常喂养，不给任何药物。假手术组：手术方法同模型制作，只在穿刺时以生理盐水0.3ml代替栓子溶液，术后不给任何药物。手术造模组：单纯造模，不给任何药物。术前中药组：中药连续灌胃10d，1.2g/（kg.d），1次/d，然后造模。术后中药组：造模后中药连续灌胃10d，1.2g/（kg.d），1次/d。术后西药组：造模后西药连续灌胃10d，0.2mg/（kg.d），1次/d。（3）行为学测验　采用跳台法，避暗法，Y型水迷津法，具体参见《药理实验方法学》（徐淑云等主编，人民卫生出版社，1991年第2版）。（4）形态学检查　将大鼠断头处死，迅速取脑，剥离皮层，海马及丘脑，光镜检查者于卡诺氏液中固定，切片做HE和苏木素纤维素染色；电镜检查者于3%戊二醛中固定，并按常规做修块、固定、脱水、包埋、切片、染色。（5）数据应用方差分析法进行统计学处理。

　　2　实验结果

　　2.1　行为学检测　学习与记忆成绩（见表1，2，3）。

表1　各组动物学习成绩比较（

　　假手术组

　　手术造模组

　　术前中药组

　　术后中药组

　　0.94±0.87**

　　2.44±1.14

　　1.05±0.93**

　　1.58±0.87*

　　1.11±0.75**

　　2.61±1.46

　　1.27±0.89**

　　1.35±1.22**

　　注：与手术造模组比较*P＜0.05，**P＜0.01

表2　各组动物记忆成绩（一次性训练24h后）比较（

　　假手术组

　　手术造模组

　　术前中药组

　　术后中药组

　　0.44±0.85△

　　1.88±1.32

　　0.22±0.64△

　　0.47±0.79△

　　0.61±0.69△

　　2.05±1.25

　　0.61±0.69△

　　1.11±1.16△

　　注：与手术造模组比较△P＜0.01

表3　跳台法观察各组动物的记忆保持

　　假手术组

　　手术造模组

　　术前中药组

　　术后中药组

注：与手术造模组比较*P＜0.05,**P＜0.01;与术后西药组比较△P＜0.05,△△P＜0.01

　　2.2　形态学检测

　　2.2.1　光镜检测　（1）HE染色　手术造模组：皮层软脑膜水肿及少部分充血，部分血管腔内见有颗粒状或丝絮状物，皮层小血管腔亦见有上述改变，同时尚可见脑实质水肿及多发软化坏死灶。神经元肿胀变性，部分细胞核呈空泡样或颗粒样变性，染色质稀疏或丢失。有小胶质细胞增生。丘脑部位观察结果基本同上。海马区广泛的锥体细胞破坏并丢失，只观察到极少量的残存神经元，可见明显的胶质细胞反应，小胶质细胞充满坏变区并可见毛细血管增生。

　　术前中药组：与手术造模组相比改善较明显，皮层软脑膜及实质血管腔内栓子明显减少（5只）或不见（4只），有的管腔内见有残留的细颗粒或细丝状遗骸，脑软化及水肿不明显，神经元变性亦不明显，有胶质细胞增生。丘脑观察结果基本同上。海马锥体细胞排列较整齐、规则，未见明显形态改变。术后中药组和术后西药组表现基本相似，与手术造模组相比，皮层和丘脑部位神经元轻度变性，可见软化灶，但有所减少，胶质细胞轻度增生。（2）苏木素纤维素染色手术造模组：软脑膜血管及脑实质小血管内多见有深蓝染色的血栓。术前中药组：血管腔内血栓可见疏松溶解呈细网状或细颗粒状。术后中药组：血管腔内有栓子存在，但呈粗网状溶解。术后西药组：血管腔内见有栓子，但明显溶解，呈细网状或颗粒状。

　　2.2.2　电镜检测　手术造模组：神经元胞体高度变性坏死，核染色质丢失并出现髓样小体，线粒体及内质网高度变性，多呈空泡样变，神经纤维变性呈“板状”分离，微血管内见红细胞、血小板及纤维素的凝集，血管内皮收缩变性，血管周边水肿。术前中药组：神经元及胶质细胞未见明显病变，血管腔内无凝集物，血管内皮无变性收缩。术后中药组与术后西药组表现基本一致，有神经元变性、核染色质稀疏、核糖体减少，神经纤维轻度变性，但未见“板状”分离，血管内皮有收缩变性，周边轻度水肿。

　　3　讨　论

　　自70年代以来，出现的大鼠脑缺血模型有几十种［1］，但均与MID有一定差异。80年代以前，有人在较大动物的颅内动脉注入血栓栓子制作栓塞性中风模型，后有人从大鼠颈总动脉注入血栓栓子制作栓塞性中风模型［2］，日本学者Kaneko［3］则从颈外动脉逆行插管至颈内动脉起始处，推注栓子使之被冲入颈内动脉。实验表明，栓子随着血液搏动的压力而收缩，而且可以粉碎［4］。形态学观察，栓子在脑内的分布是广泛的，但大脑中动脉区域肯定被累及，且栓子注入的同侧和对侧的脑部均有梗塞灶存在［4］。国内学者陈俊抛等根据Kaneko方法，进而进行了多发脑梗塞模型和多发梗塞性痴呆模型的制备［5］。

　　本实验根据Kaneko和陈氏方法并加以改进，首先在注入栓子同时，开放颈总动脉，并在不少于30秒的时间内缓慢注入栓子，使之随血流广泛分布于脑内各区域，以期更接近临床。另外，减少注入栓子溶液量至0.3ml。这两方面保证了造模后48h内死亡率控制在10%～15%以内。造模后进行的行为学和病理形态学检查均表明，本模型与MID的临床症状及病理改变非常相似。

　　本模型也存在不足：（1）栓子在进入颅内动脉的同时也进入翼突腭动脉，造成颅外梗塞。（2）术后结扎了颈外动脉。

　　应用此模型，我们观察了中药复方制剂“健脑益智冲剂”和西药喜得镇（Hydergine）对于MID模型的影响，结果表明：它们均可改善其下降的学习能力（P＜0.01或0.05），且造模前给予“健脑益智冲剂”不仅可以提高MID模型下降的记忆保持力，而且明显优于喜得镇，病理形态学检查支持上述结果。这提示我们，利用中医中药防治本病有着一定的优势。

　　参考文献

　　1MyronD,Ginsberg,RaulBusto.Rodentmodelsofcerebralischemia.Stroke,1989,20:1627.

　　2KudoM,AoyamaA,IchimoriS,etal.Ananimalmodelofcerebralinfarction，Homologousbloodclotemboliinrats.Stroke,1982,13:505.

　　3KanekoD,NakamuraN,OgawaT.Cerebralinfarctioninratsusinghomologousbloodemboli:developmentofanewexperimentalmodel.Stroke,1985,16:76.

　　4SiegelBA,MeidingerR,ElliottAJ,etal.Experimentalcerebralmicroembolism，Multipletracerassessmentofbrainedema.ArchNeurol,1972,26:73.

　　5陈俊抛，田时雨，于薇薇，等.多发性脑梗塞痴呆动物模型的研究.中华神经精神科杂志，1994，27（5）：311.

（1997-10-21收稿　1998-11-10修回）