益智胶囊对多发性梗塞性痴呆大鼠脑组织和血清SOD及MDA的影响

陈宇翔马秀良　徐浩包头市土右旗医院内科（内蒙古包头014100）【摘要】目的探讨益智胶囊对多发性梗塞性痴呆（Multi-infarctdementia,MID）大鼠脑组织和血清SOD及MDA的影响。方法采用同种大鼠无菌自然干燥血凝块颈动脉注射及跳台反射第1次跳下潜伏期为筛选指标，成功地建立了MID大鼠模型。在此基础上，观察益智胶囊对其学习记忆能力、血清和脑组织丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量及超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD）活力以及多发性脑梗塞大鼠脑组织形态结构的影响。结果MID大鼠模型出现了明显的学习记忆障碍，其脑组织匀浆SOD活力显著下降，血清及脑组织MDA含量显著升高。益智胶囊可明显改善MID大鼠学习记忆能力，升高脑组织SOD活力，降低血清及脑组织MDA含量，对多发性脑梗塞大鼠脑组织形态结构具有保护作用。结论益智胶囊治疗MID的作用机理可能与其抑制脂质过氧化及减轻脑组织缺血损伤等作用有关。【关键词】益智胶囊血管性痴呆中医药疗法［中图分类号］R944.5［文献标识码］A［文章编号］1810－5734（2008）1-0001-03EffectofYizhiCapsuleonSODandMDAinSerumandBrainTissueofMulti-infarctDementiaRats.ChenYuxiang,MaXiuliang,XuHao.TheInternalmedicinedepovrtmentofTuYouqi.（BaoTou014100）【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectofYizhiCapsuleonSODandMDAinserumandbraintissueofmulti-infarctdementiarats.MethodsMIDratmodelswereestablishedsuccessfullywithsterileanddrybloodclotsofthesamekindrat,basedonwhich,theeffectofYizhiCapsuleonlearningandmemory,MDAcontentandSODactivityinserumandbraintissue,andbrainmorphosisofmulti-infarctratswereobserved.ResultObviousmalfunctionoflearningandmemorywasfoundinMIDratmodels,andtherearealsosignificantdecreasingofSODactivityinbrainandincreasingofMDAcontentinserumandbrain.YizhiCapsulecouldobviouslyimprovelearningandmemory,raiseSODactivityinbrain,lowerMDAcontentinserumandbrainofMIDratmodels,protectbrainmorphosisofmulti-infarctrats.ConclusionYizhiCapsulemighttreatMIDbyrestraininglipidperoxidationanddecreasingischemicdamageofbraintissue.【Keywords】YizhiCapsuleVasculardementiaSODMDA山东省教委课题的部分内容（No.J95K37）多发性梗塞性痴呆（multi-infarctdementia,MID）是我国老年期痴呆中最常见的一种，严重威胁着老年人的身心健康。我们根据中医学精气神理论，针对MID患者肾精亏虚、神明失用之病机特点，提出“益精提神法”为本病的治疗大法，据此组方并制成益智胶囊，用于MID的防治取得了较好的疗效［１，２］。为进一步探讨其作用机理，我们采用同种大鼠无菌自然干燥血凝块颈动脉注射及跳台反射第一次跳下潜伏期进行筛选，成功地建立了MID大鼠模型，并观察了益智胶囊对该模型血清和脑组织SOD及MDA的影响，以期为中医药治疗MID提供有意义的线索。1材料与方法1.1动物：Wistar大鼠160只，雄性，鼠龄12～15个月，体重350～450g，由山东省防疫站动物中心提供（合格证：鲁动质950103号）。1.2药物：益智胶囊由人参6g制首乌15g淫羊藿12g知母9g川芎12g水蛭6g石菖蒲9g远志6g组成，山东省分析测试中心制剂生产（批号：960803），每粒含药粉0.228g，每克药粉相当于生药10g，配成0.2g/ml混悬液备用；脑复康为东北制药厂生产（批号：9410100），配制成0.032g/ml混悬液备用。1.3试剂及仪器：MDA及SOD测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；跳台反射箱及水迷宫，参照《中药药理实验方法学》［３］制成；723分光光度计，上海分析仪器厂产。1.4实验方法1.4.1MID大鼠模型制作：取鼠龄12～15个月的Wistar大鼠100只进行跳台实验，以大鼠第1次跳下潜伏期为痴呆大鼠筛选指标。实验时，首先将大鼠放在跳台反射箱内适应3min后，通电3min作预测验，24h后正式测验，记录每只大鼠第1次跳下潜伏期，求出均值（X）及标准差（S），按统计学方法参照公式X±1.96S求出正常范围的最低限为72.50s。另取同种条件Wistar大鼠，参照陈俊抛等［4］的方法略加改进制作多发性脑梗塞动物模型。术后第10天，取存活的大鼠，用跳台实验测定每只大鼠的第1次跳下潜伏期，凡潜伏期<72.50s的大鼠即认为是MID大鼠模型。1.4.2分组及给药方法：将术后存活的36只大鼠随机分为4组：假手术组、模型组、脑复康组及益智胶囊组，每组9只。其中假手术组以等量生理盐水代替栓子盐水悬液注入颈总动脉，余同造模组。各组动物均从术后第11天起开始灌胃给药，在造模基础上分别给予生理盐水、生理盐水、脑复康、益智胶囊，每日1次，1ml/100g体重，连续15天。1.4.3学习记忆能力的测定方法：采用水迷宫法。以大鼠自迷宫起点游至终点安全台所需时间和途中进入盲端的错误次数，作为学习获得和记忆巩固的指标。于术后第21天进行测试，具体操作按吴江等［5］介绍的方法进行。1.4.4MDA、SOD测定方法：术后第26天处死动物，每组9只。眼球取血，立即离心（3000r/min）10min，吸取上清液（即血清）备用；快速断头，取脑组织块约0.3g，用冰生理盐水冲洗除去血液，滤纸拭干，称重，加入9倍于组织块重量的冷生理盐水中，用玻璃匀浆器在冰水中制备组织匀浆，直至涂片在显微镜下观察到细胞已磨破为止，即得10％脑组织匀浆。取出0.1ml加0.9ml冷生理盐水即得1％脑组织匀浆，将匀浆以4000r/min离心10min，分别取0.1ml和30μl用于测MDA和SOD。1.4.5多发性脑梗塞大鼠脑组织形态结构的观察动物、分组、给药量同前。造模仍参照陈俊抛等［４］的方法略加改进。于术前3天开始给药，至术后第15天结束。将动物快速断头取脑，10％福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光学显微镜下观察脑组织的形态结构。1.5统计学分析方法：所有实验数据以x±s表示，各组之间用t检验判断比较差异的显著程度。2结果2.1对MID大鼠学习记忆能力的影响2.1.1对MID大鼠学习获得能力的影响：模型组大鼠学习游迷宫所需时间明显长于假手术组，在游迷宫途中进入盲端错误次数也显著多于假手术组（P<0.01），说明模型组大鼠出现了明显的学习获得能力障碍。益智胶囊组大鼠学习游迷宫所需时间明显短于模型组及脑复康组，在游迷宫途中进入盲端错误次数也显著少于模型组及脑复康组（P<0.01，P<0.05）；而脑复康组学习游迷宫所需时间也短于模型组，途中进入盲端错误次数也少于模型组，但除了第4天统计学处理有显著性差异（P<0.05）外，其余几天脑复康组与模型组比较无显著性差异（P>0.05）。见表1。〖HJ1.3mm]〖JZ〗表1对MID大鼠学习获得能力的影响（x±s）〖BG（!〗〖BHDFG4，WK5，WK4，WK45W〗组别〖〗鼠数〖〗〖ZB（〗〖BHDZG2，WK45W〗学习游迷宫所需时间（s）学习游迷宫错误次数〖BHDZG2，WK9。5W〗第1天〖〗第2天〖〗第3天〖〗第4天〖〗第5天〖ZB）〗〖BHDZG2，WK8，WK6，WK8。5W〗〖HT5”，6”〗假手术组〖〗9〖〗65.66±17.12**〖〗43.34±16.77**〖〗30.94±10.22**〖〗24.67±10.36**〖〗16.85±6.78**〖BHDWG1*2〗〖〗〖〗4.17±0.98**〖〗2.53±0.95**〖〗1.85±0.76**〖〗1.28±0.73**〖〗0.65±0.64**〖BH〗模型组〖〗9〖〗92.58±16.32〖〗71.67±13.29〖〗55.23±14.38〖〗47.62±10.24〖〗38.73±7.64〖BH〗〖〗〖〗7.56±1.24〖〗5.61±0.96〖〗4.90±0.88〖〗4.20±0.67〖〗3.68±0.69〖BH〗脑复康组〖〗9〖〗84.48±14.73〖〗65.48±14.67〖〗48.49±11.55〖〗36.33±11.45*〖〗31.52±8.76〖BH〗〖〗〖〗6.38±1.13〖〗4.63±1.03〖〗4.04±0.92〖〗3.45±0.68*〖〗2.98±0.73〖BH〗益智胶囊组〖〗9〖〗68.57±16.89**△〖〗49.37±15.64**△〖〗34.79±12.46**△〖〗26.75±9.38**〖〗17.18±8.46**△△〖BH〗〖〗〖〗4.56±0.92**△△〖〗2.67±0.82**△△〖〗1.92±0.75**△△〖〗1.31±0.72**△△〖〗0.72±0.61**△△〖BG）F〗〖HT5”SS〗注：与模型组比较，*P<0.05**P<0.01；与脑复康组比较，△P<0.05△△P<0.01；2.1.2对MID大鼠记忆巩固能力的影响：模型组大鼠游迷宫所需时间明显长于假手术组，在游迷宫途中进入盲端错误次数也显著多于假手术组（P<0.01），说明模型组大鼠出现了明显的记忆巩固能力障碍。益智胶囊组大鼠游迷宫所需时间及进入盲端错误次数均少于模型组及脑复康组（P<0.01，P<0.05）；而脑复康组游迷宫所需时间及进入盲端错误次数也少于模型组，但除了第2天统计学处理有显著性差异（P<0.05）外，其余几天脑复康组与模型组比较无显著性差异（P>0.05）。见表2。2.2对MID大鼠脑组织匀浆和血清SOD及MDA含量的影响：MID大鼠脑组织匀浆SOD活力显著下降，血清及脑组织MDA含量显著升高，与假手术组比较有显著性差异（P<0.01），血清SOD活力亦有下降趋势，但与假手术组比较无显著性差异（P>0.05）。益智胶囊能明显升高脑组织匀浆SOD活力，降低脑组织MDA含量，较模型组及脑复康组均有显著性差异（P<0.01，P<0.05）；在降低血清MDA含量方面与模型组有显著性差异（P<0.05）；而血清中SOD活力与模型组比较无显著性差异（P>0.05）。脑复康组血清及脑组织匀浆SOD活力均较模型组有上升趋势，MDA含量较模型组有下降趋势,但统计学处理无显著性差异（P>0.05）。见表3。〖JZ〗表2对MID大鼠记忆巩固能力的影响（x±s）〖BG（!〗〖BHDFG4，WK8，WK6，WK40W〗组别〖〗鼠数〖〗〖ZB（〗〖BHDZG2，WK40W〗游迷宫所需时间（s）学习游迷宫错误次数〖BHDZG2，WK8。5W〗第1天〖〗第2天〖〗第3天〖〗第4天〖〗第5天〖ZB）〗〖BHDZG1*2，WK8，WK6，WK8。5W〗〖HT5”，6”〗假手术组〖〗9〖〗36.26±9.67**〖〗19.20±5.29**〖〗16.51±3.64**〖〗15.77±2.26**〖〗14.93±1.87**〖BHDWG2〗〖〗〖〗3.42±0.75**〖〗1.82±0.58**〖〗1.57±0.43**〖〗1.39±0.43**〖〗1.28±0.25**〖BH〗模型组〖〗9〖〗65.51±13.99〖〗46.42±10.84〖〗35.12±7.32〖〗26.25±7.95〖〗23.21±4.62〖BH〗〖〗〖〗6.40±1.24〖〗3.56±1.04〖〗2.91±0.96〖〗2.32±0.68〖〗1.82±0.44〖BH〗脑复康组〖〗9〖〗52.94±12.13〖〗35.20±8.26〖〗29.23±5.49〖〗21.25±4.95*〖〗19.96±4.38〖BH〗〖〗〖〗5.48±0.92〖〗2.61±0.85〖〗2.17±0.84〖〗1.89±0.57*〖〗1.63±0.39〖BH〗益智胶囊组〖〗9〖〗38.15±9.62**△〖〗20.89±5.42**△△〖〗17.19±3.30**△△〖〗16.95±2.96**△△〖〗14.86±2.04**△△〖BH〗〖〗〖〗3.79±0.68**△〖〗1.80±0.52**△〖〗1.52±0.31**△〖〗1.43±0.30**△〖〗1.31±0.21**△〖BG）F〗〖HT5”SS〗注：与模型组比较，*P<0.05**P<0.01；与脑复康组比较，△P<0.05△△P<0.01；〖HJ1.5mm]〖JZ〗表3对MID大鼠脑组织匀浆和血清SOD及MDA含量的影响（x±s）〖BG（!〗〖BHDFG4，WK9。2，WK36W〗组别〖〗鼠数〖〗〖ZB（〗〖BHDZG2，WK18。2W〗SOD（NU/ml）〖〗MDA（μmol/L）〖BHDZG2，WK9。4W〗血清〖〗脑组织〖〗血清〖〗脑组织〖ZB）〗〖BHDZG2，WK9。6W〗〖HT5”，6”〗假手术〖〗9〖〗175.54±34.06〖〗160.48±36.93〖〗1.25±0.31〖〗1.27±0.30〖BHDWG2〗模型〖〗9〖〗158.32±28.11〖〗89.36±22.17*△△〖〗1.64±0.43*△〖〗1.79±0.38*△△〖BH〗脑复康〖〗9〖〗160.49±30.07〖〗112.28±31.15△△〖〗1.58±0.64〖〗1.70±0.43△〖BH〗益智胶囊〖〗9〖〗173.64±37.36〖〗156.39±33.83〖〗1.27±0.28〖〗1.31±0.30〖HT5”〗〖BG）F〗注：与假手术组比较，*P<0.01；与益智胶囊组比较，△P<0.05，△△P<0.012.3对多发性脑梗塞大鼠脑组织形态结构的影响：假手术组：锥体细胞大小形态正常，核仁清晰,突起较长，血管周围间隙窄，未见梗塞灶；模型组：可见多个梗塞灶，灶中有胶质细胞增生,锥体细胞胞体缩小变形，核固缩呈三角形或条索状，核仁不清，突起消失，毛细血管呈条索状，血管周围间隙明显增宽；脑复康组：可见多个梗塞灶,但灶较小，灶中亦有胶质细胞增生，锥体细胞胞体缩小及核固缩较模型组略轻，但核仁不清,突起明显缩短或消失，血管周围间隙较模型组略窄；益智胶囊组：梗塞灶较模型组及脑复康组少，梗塞程度轻,灶中可见轻度胶质细胞增生，锥体细胞大小形态接近正常，核仁较清晰,突起较长，毛细血管周围间隙较窄。讨论MID作为我国老年期痴呆的一种主要类型，正越来越引起医学界的重视。由于目前国内外尚缺乏MID模型，对MID治疗药物的研究也因之而受到限制。陈氏［４］报道用同种大鼠无菌自然干燥血凝块复制出MID模型，但由于栓塞部位不定，栓塞面积大小不等，动物并未全部出现学习记忆障碍,在此基础上进行的药效学观察，得出的结果也必然不令人信服。我们采用跳台反射实验第一次跳下潜伏期为筛选指标，较为客观地筛选出MID大鼠，病理观察发现，痴呆组大鼠梗塞灶的数目、体积明显大于非痴呆组大鼠,梗塞灶常位于额叶、颞叶等部位。而临床观察已证实,多发性脑梗塞患者是否出现痴呆,除与梗塞灶数目、体积有关，与梗塞部位亦有密切关系,常见于额叶、颞叶及丘脑等部位。本模型建立对MID治疗药物的选择和效果评定有一定意义。但是,由于痴呆大鼠筛选指标的界定受动物种系、年龄、仪器、环境等多因素的影响,使其应用有一定局限性，这有待于今后进一步规范化。SOD是体内重要的抗氧化酶，其活力可反映机体清除氧自由基的能力；MDA是体内过氧化作用的最终产物，其含量高低间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度［6］。目前，有关老年期痴呆血清SOD、MDA含量的研究报道较少，结果也不尽一致。本研究结果表明，MID大鼠出现了明显的学习记忆障碍，其脑组织及血清MDA含量显著升高，脑组织SOD活力显著下降，与假手术组比较有显著性差异。其原因可能是脑缺血时，细胞内钙超载致自由基生成过多，消耗大量抗氧化剂，使SOD活力失代偿性下降，从而启动自由基链锁反应，进一步破坏神经细胞的结构与功能［7］。特别是缺血超过时限，当血液再灌流时，由于此时细胞器已发生了不可逆的损伤，新进入的氧不能进行代谢，于是在黄嘌呤氧化酶等的催化下生成新的氧自由基引发恶性循环，造成激烈的连锁反应，使缺血脑细胞的损伤进一步加重，这已被许多实验与临床所证实［8，9］。自由基增多可引起蛋白质分子结构疏散、核酸链断裂和多糖解聚；而过氧化脂质的形成又会造成生物膜系统损伤，影响线粒体氧化磷酸化，损伤细胞的结构和功能［10］。因此我们认为，MDA及SOD的变化很可能是MID形成和发展的一个重要的生物化学原因。至于血清中SOD活力变化不明显，这可能是SOD为一种大分子蛋白酶，且带负电荷，不能通过血脑屏障到达脑组织［7］，因此虽然脑部SOD活力下降，但血浆SOD活力没有下降。我们既往的研究表明，MID大鼠血清Cu、Zn、Se含量明显下降，益智胶囊能明显升高其血清Cu、Zn、Se水平,提示这可能是其益智的作用机理之一［11］。本研究表明，益智胶囊在明显改善MID大鼠学习记忆障碍的同时，能升高MID大鼠脑组织SOD含量，降低脑组织及血清MDA含量，减轻多发性脑梗塞大鼠脑组织的缺血损伤程度，提示这可能也是其治疗MID的作用机理之一。参考文献［１］徐浩，邵念方，崔德芝，等.益智胶囊预防血管性痴呆作用的临床研究.中医杂志1997；38（8）：480-482.［2］徐浩.益精提神法治疗多发性梗塞性痴呆的临床研究.山东中医药大学学报1998；22（2）：111-114.［3］李仪奎主编.中药药理实验方法学.上海：上海科学技术出版社，1991：173.［4］陈俊抛，田时雨，于薇薇，等.多发性脑梗塞痴呆动物模型的研究.中华神经精神科杂志1994；（6）：311.［5］吴江，刘多三，张昱，等.无名质区注射Ibotenic酸对大鼠学习、记忆的影响.中风与神经疾病杂志1991；（3）：133.［6］周玫.自由基医学.北京：人民军医出版社，1991：442.［7］SchmidleyJW.Freeradicalsincentralnervoussystemischemia.Stroke1990；21：1086.［8］BozzoL.Earlycollateralbloodsupplyandlateparenchymalbraindamageinpatientwithmiddlecerebralarteryocclusion.Stroke1989；20：735.［9］玄汉石.氧自由基在家兔不完全性脑缺血再灌流损伤中的作用.中风与神经疾病杂志1992；（9）：132.［10］黄青.益聪方与增智方对老年痴呆模型作用的研究.北京中医药大学学报1996；（5）：58.［１1］徐浩，邵华强，胡春雨，等.益智胶囊对多发性梗塞性痴呆大鼠血清钙、镁、铜、铁、锌、硒的影响.中药新药与临床药理1998；9（3）：166.