首页>疾病百科> 淋巴细胞减少症

论文:Graves病伴血细胞减少症患者外周血淋巴细胞的研究

2009-12-02 www.chxing.com A +

同时符合以下标准:①高代谢症状和体征;②弥漫性甲状腺肿大伴或不伴血管杂音;③血清FT4增高,TSH减低。初诊时血常规检测中仅伴血小板减少者10例,其Plt值(10-78)×109/L;血小板及白细胞均减少9例,其Plt值(30-60)×109/L,WBC值(1.23-3.78)×109/L;全血细胞减少5例,WBC值(2.3-2.58)×109/L,Hb值(70-85)g/L,Plt值(57-70)×109/L。18名正常对照者中,男5例,女13例,年龄18-58岁,平均年龄40.1岁。

所用鼠抗人CD4、IFNγ、IL4、CD5、Bcl2单克隆抗体和鼠抗人CD19单抗克隆抗体均购自美国Ancell生物制剂公司,牛血清白蛋白和RPMI1640购自深圳晶美公司,聚甲基丙烯酸、依若霉素、莫能霉素及皂素购于美国Sigma公司。流式细胞仪为BeckmanCoulter公司产品。

外周血单个核细胞分离

采集患者及正常对照者的外周血4ml,以5íTA抗凝,800r/min离心10分钟,去上清,加入细胞培养液RPMI1640至4ml,混匀,用PBS等量稀释后分装于2个离心管中,用Ficoll淋巴细胞分离液(密度1.077)分离单个核细胞。

细胞培养及细胞因子分泌抑制

细胞按5×105/ml的浓度培养,并加入PMA和依若霉素以扩大原有细胞因子的产量,用莫能霉素抑制高尔基体对细胞因子的转运。基本培养基为IMDM,体系如下:10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50ng/mlPMA、250ng/ml依若霉素、140ng/ml莫能霉素。细胞与培养液混合后加入到24孔板中,在37℃、95%湿度、5%CO2培养箱内培养5小时。

用结合异硫氢酸荧光素(FITC)的鼠抗人CD4单克隆抗体直接标记细胞膜CD4,用结合藻红蛋白荧光素的鼠抗人IFNγ、IL4单克隆抗体直接标记细胞浆内的IFNγ、IL4,Th1细胞为CD4+、IFNγ+,Th2细胞为CD4+、IL4+。

CD19+CD5+细胞测定

试管中加入鼠抗人CD19FITC和鼠抗人CD5PE各20μl,再加入单个核细胞悬液100μl,混匀,4℃避光孵育40分钟,PBS液洗2遍,加入10g/L的多聚甲醛固定液200μl,混匀,4℃固定30分钟。对照管中加入鼠抗人CD19FITC和鼠抗人IgG1PE各20μl,按上述方法操作。最后用流式细胞术测定CD19+CD5+细胞,计算CD19+CD5+/CD19+的表达率。

B淋巴细胞胞浆内Bcl2表达测定

加入鼠抗人CD19FITC20μl,单个核细胞悬液100μl,4℃避光孵育30分钟,用PBS液洗2遍,加入1%的多聚甲醛固定液1ml,混匀,在4℃条件固定15分钟,各加入含1g/L皂素的PBS1ml,室温孵育60分钟,用PBS液洗2遍。在试验管中加入鼠抗人Bcl2PE单克隆抗体各20μl。对照管中加入同型不相关鼠抗人IgG1PE单克隆抗体各20μl,4℃避光孵育40分钟,用PBS液洗3遍,然后加入1%的多聚甲醛固定液200μl,混匀,4℃固定30分钟。流式细胞术测定CD19+细胞胞浆内Bcl2表达率。用流式细胞仪(FACSVantageBectonDickinson公司产品)进行细胞测定,用cellQuest3.1获取和分析细胞。

使用SPSS10.0软件分析,结果以均值±标准差(±SD)表示,计量资料的比较用t检验。

CD4+IFNγ+、CD4+IL4+细胞的检测

患者组CD4+IFNγ+和CD4+、IL4+细胞百分率增加(0.812±0.45),显著和高于正常对照组(0.39±0.24),(P<0.05),且CD4+IL4+升高更为显著(P<0.01);患者组CD4+IL4+/CD4+IFNγ+比值为20.55±6.15,而正常对照组0.52±0.12(P<0.01),提示CD4+IFNγ+/CD4+IL4+比例失衡,尽管CD4+IFNγ+细胞相应增加,仍未能使之平衡(图1、附表)。

患者组外周血CD5+CD19+细胞占CD19+细胞的比例为(20.89±1.62)%,正常对照组为(7.89±0.38)%,患者组明显高于正常对照,差异有显著性(P<0.05)。患者组CD5+CD19+细胞中位荧光强度(20.6±2.74)%,明显高于正常对照(9.78

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