原发性胆汁性肝硬化外周血中颗粒溶素的基因表达水平的检测推荐到首页 □ 《中华实用医药杂志》2006年第09期1/4页1234
【关键词】pbc；,gnly；逆转录-聚合酶链反应
【摘要】目的用实时荧光定量rt-pcr的方法测定pbc患者外周血中gnly的基因表达水平，探讨gnly在原发性胆汁性肝硬化（pbc）的表达及意义。方法采用taqman探针技术，以18srna为内对照，测定了60例pbc性心脏病患者外周血中gnlymrna的含量，以健康对照组为对照。结果gnlymrna在60例pbc患者的表达范围为5.35×107～4.61×109拷贝/μgrna，均值为（2.7±2.5）×108拷贝/μgrna；100例健康对照者均值为（3.0±1.9）×107拷贝/μgrna。pbc组gnlymrna的含量显著高于疾病对照乙型肝炎肝硬化组和健康对照组（p<0.01）。结论通过fq-pcr方法检测出pbc患者gnlymrna的含量显著高于健康对照组，gnly表达与pbc的发生发展存在一定的关联性。
【关键词】pbc；gnly；逆转录-聚合酶链反应
原发性胆汁性肝硬化（primarybiliarycirrhosis，pbc）是一种原因不明的自身免疫性肝病，胆小管出现进行性破坏性炎症反应，肝内出现慢性胆汁淤积，进一步发展成肝纤维化和肝硬化，最终患者只能依靠肝移植免于死亡［1］。pbc患者胆管破坏伴随着门脉淋巴细胞浸润，主要为活化的cd8+t和cd4+t细胞，cd8+t细胞介导的免疫反应参与pbc中胆管上皮细胞和肝细胞破坏的发病过程［2］。颗粒溶素（granulysin，gnly）是nk（naturalkiller，nk）细胞和细胞毒性t淋巴细胞（ctl）表达的一种溶细胞分子，在机体免疫应答过程中，它先通过胞吐作用从胞浆颗粒中排出，然后在胞外发挥其细胞毒作用［3］。本研究主要是利用实时荧光定量rt-pcr的技术，建立一种灵敏快速地检测gnly基因表达的方法，并从分子水平探讨gnlymrna在pbc患者外周血中的表达及临床意义。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象60例经临床确诊的pbc患者均为长征医院住院病人，其诊断均符合美国肝病学会（aasld）2000年推荐的pbc诊断标准［4］，其中男5例，女55例，男女比例为1：11，发病年龄（45.6±10.2）岁。正常对照组为100例健康体检者。
1.1.2主要仪器和试剂rneasyminikit（qiagen），taqmanreversetranscriptionregents（appliedbiosystem），淋巴细胞分离液（上海生化试剂公司），taqman2×pcrmastermix，taqmanreversetranscriptionregents（appliedbiosystem），引物及taqman水解探针的合成（上海生工）、dna测序分析（上海联合基因生物技术公司）。geneamp7900sequencedetectionsystems（美国pebiosystems公司）。
1.1.3引物、探针的设计与合成用beacondesigner2.1软件设计gnly和18srrna的基因专一性的引物和探针，gnly上游引物：5’actgaagaagatggtggataagcc3’；下游引物：5’gccctgggtaactctagactga3’；探针:famcggaacctccagtcagaagaccagatamra。内参18srrna上游引物：5’acatccaaggaaggcagcag3’；下游引物：5’ttcgtcactacctccccgg3’；探针:famcgcgcaaattacccactcccgatamra。正反向引物、taqman探针（famtamra标记）均由上海生工生物技术公司合成。
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