羊痘（capripoxu，CP）又名羊“天花”，是由羊痘病毒引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病。本病特征是发热，无毛或少毛部位皮肤黏膜发生丘疹和疱疹（王开功等，2003）。羊痘是所有动物痘病中最为严重的一种，中国将其列为类动物疾病（张振岚等，2000），本病的发生容易造成巨大经济损失；严重影响国际贸易和养羊业的发展（Mohamed等，1982）。1羊痘病毒的生物学特性羊痘病毒可引起山羊痘（goatpox，GTP）、绵羊痘（sheeppox，SPP）和牛的结节性疹块病（1umpyskindisease，LSD），山羊痘病毒，绵羊痘病毒，牛的结节性疹块病之间在血清上呈交叉反应，但在自然条件下不会发生交叉感染，它们同为痘病毒科（poxviridea），脊椎动物痘病毒亚科（chordovoxrinae），羊痘病毒属（capripoxvirus）的成员（邓伟等，2002），其是唯一在细胞浆中复制的有囊膜双股DNA病毒，呈椭圆形，大小为167nm×292nm（郭爱珍等，2001）。绵羊痘病毒和山羊瘟病毒量因组约有150kb，彼此十分相似，约有96%的核苷酸完全相同（许乐仁等，2003）。和其他痘病毒一样，羊痘病毒基因组包括中间编码区和两端相同的反向末端重复序列（康文玉等，2004）。绵羊痘病毒和山羊痘病毒基因组共有147个开放阅读框（ORF），编码密度为93%，所编码的蛋白为53～2027个氨基酸不等（张前群等。2004）。基因组中间的区域（ORFs024-123）有与其它痘病毒同源的保守序列，编码病毒复制所需的蛋白，其功能主要是负责病毒的转录、修饰RNA、病毒DNA的复制及在胞内组装成熟、在胞外被蛋白膜包裹成成熟的病毒粒子。两端基因序列（ORFs001-023和ORFs124-147）包括1个基因家族（由8个基因组成）及其他与病毒修饰或逃避宿主免疫识别和反应相关的基因，负责编码胞质分裂丝蛋白、白细胞介素-10（IL-10）、表皮生长因子样蛋白（EGF-likeprotein）、PKR阻遏蛋白等，还有痘病毒所特有的致病基因和选择宿主范围基因（孙桂玲等，2004）。羊痘病毒是一种亲上皮性的病毒，大量存在于病羊的皮肤、黏膜的丘疹、脓疮及痂皮内。鼻黏膜分泌物也含有病毒，在血液内仅在发病初期检测剂病毒，体温上升时有病毒存在。羊痘病毒对直射阳光、酸、碱和大多数常用消毒药均较敏感（敖特根夫等，2002）。耐干燥，在干燥的痂皮内能成活数月至数年，在干燥羊舍内可存活6～8个月。对热敏感，55℃、30min即可灭活。在3%的石炭酸、5%的甲醛、2%～3%的硫酸、10%高锰酸钾中几分钟即可杀死。本病毒对10%漂白粉、2%的硫酸锌溶液有一定的抵抗力（亢兆麟等，2002）。2重组羊痘病毒的构建病毒重组一般是用基因组直接修饰后再次拯救；质粒导入感染细胞后的重组或病毒间替换的方法来完成的（Han等，2002）；由于羊痘病毒的基因组庞大而复杂，不便于在体外直接进行DNA重组，因此依靠转移载体的协助将外源基因导入羊痘病毒基因组的方法来完成重组，这也是最认同的方法（Romero等，1994）。采用同源重组方法构建重组羊痘病毒的关键是理想的病毒转移载体及其构建方法，而非必需区的克隆和筛选是病毒活载体构建的先决条件。另外，在病毒载体构建时，还应考虑外源基因表达的调控元件（Wade-Evans等，1996）。而选择合适的启动子、建立羊痘病毒同源整合和重组羊痘病毒的筛选方法是能否获得重组病毒的关键（程小文等，2006）。2.1转移载体的构建2.1.1基因组复制非必需区的克隆外源基因首先要插入到病毒基因组中对应的病毒复制非必需的区域，因此非必需区的克隆和筛选是病毒活载体构建的先决条件。非必需区的克隆策略可分为两类，一类是定向克隆的策略，适合于分子背景比较清楚的病毒，通过结构与功能研究已确定了一个或一个以上的非必需区，用此法可以快捷的获得非必需区，21世纪初SPPV、GTPV、LSDV等CPV的基因组全序列均已测出，结合其他痘病毒的研究基础，为克隆CPV的非必需区提供了必备条件；另一类是随机克隆的策略，适合于遗传背景不清楚的病毒，即采用鸟枪法克隆基因组片段，通过功能性研究筛选非必需区（BUller等，1985）。胸苷激酶（thymidinekinase，TK）基因是病毒复制的非必需基因，而且也是羊痘病毒的一个毒力基因。此基因的缺失可导致其毒力降低2～3个数量级，是重组羊痘病毒研究中最常用的插入位点，通过TK等基因的缺失可使病毒的毒力减弱（Han等，2002）。2.1.2外源基因痘病毒转录的特点决定了外源基因必须符合以下原则：外源基因应是无自身启动子的单纯编码阅读框，因为痘病毒只能识别自家的启动子。外源基因必须是连续的、无内含子的通读框，因为痘病毒mRNA无剪接功能。外源基因内容不应含有与痘病毒早期转录终止信号TTTTTNT相同的编码序列，若有则应采用变异技术以另外的简并密码子替换，否则将导致转录的中止。2.1.3启动子构建重组病毒必须要有合适的启动子，但启动子本身必须被病毒感染的细胞或病毒本身所识别，因为存在同源重组的现象，一般不采用病毒自身的启动子，防止在病毒的基因组插入相同的片段。外源基因在重组病毒中的表达水平，主要受启动子的影响。在选用启动子时应注意以下问题：①选用的启动子应强；②痘病毒因自身复制的特殊性，应选用病毒科内的启动子，其它病毒一般可选用其它的真核启动子，前提是可被病毒感染细胞所识别；③一些复杂病毒（如痘病毒和疱疹病毒）的启动子有早期和晚期之分，用不同时期的启动子将影响外源基因的表达时相及表达产量，一般采用晚期启动子或兼有早晚期2种功能的启动子；④一般来说，外源基因的起始密码子距启动子越近，外源基因的表达效果越好。这里需要指出的是，复杂病毒基因的调控是相互有影响的，影响启动子功能的因素是十分复杂的。因此，一个表达系统中的强启动子应用于另一个系统，未必就是强启动子。2.2同源整合外源DNA基因插入转移载体的羊痘病毒复制非必需区DNA片段中，通过病毒DNA与质粒载体上羊痘病毒的DNA片段之间的同源重组而插入到病毒基因组中，同时羊痘病毒的该非必需区DNA的表达也被破坏，形成基因缺失染性，为了实现插入载体与羊痘DNA之间的同源重组，通常先以野生型羊痘病毒感染易感细胞，然后将质粒载体用磷酸钙沉淀或脂质体包裹的方法导入已感染羊痘病毒的细胞中，其转染方法大致可分为3种：①接种羊痘病毒后将病毒转移载体以脂质体或磷酸钙转染入细胞内，因为羊痘病毒可在细胞浆中复制，转染的质粒也存在于细胞浆中；②纯化病毒DNA和质粒共转染，但要求纯化的病毒基因组具有感染性；③重组病毒拯救方法，即在转移载体与病毒DNA共转染后接种病毒，重组效率可大大提高。通过适当的方法分离纯化重组病毒（郭巍等，2005）。2.3重组病毒的筛选对于标记基因的选择主要遵循以下几个原则。首先应该有一个简单、快捷、灵敏及经济的分析方法检测标记基因的表达产物，标记基因蛋白总与标记基因可转录的mRNA总数一致；其次，在靶细胞中不存在或仅存在极微量的与标记基因分子相同或相似的内源性蛋白或酶的活性；如果要求分析启动子活性的大小，则标记基因分子的分析结果应具有很宽的线性范围；最后，标记基因的表达必须不改变受体细胞或生物体的生理活性。每一种标记基因及其相应的分析系统都有各自的特性和局限性，在选择时应根据需要加以考虑。目前，最常用的方法是通过化学底物及颜色变化等进行筛选，即在病毒基因组中插入报告基因。重组病毒筛选方法一般有3种：①以病毒本身的TK基因作为选择标记，采用TK基因构建转移载体质粒，在病毒感染的表型为TK-的细胞内发生同源重组，形成TK-并带有外源基因的重组痫毒；在营养液中加入5-溴尿嘧啶脱氧核苷（BudR），TK+；病毒不能存活，而TK-重组病毒能增殖。这一系统需要适合病毒生长并能产生空斑的TK-细胞系，目前，在重组痘苗系统中应用较多。②是较常用方法，其选择系统是以细菌β-半乳糖苷酶（LacZ）基因、绿色荧光蛋白（GFP）基因等作为选择标记，在构建转移载体时，将报告基因和外源基因共表达或串连2个表达盒。LacZ与其底物x-gal呈蓝色反应，在含有X-gal的培养条件下可筛选到蓝色空斑的重组病毒；绿色荧光蛋白（（GFP）与蓝色荧光蛋白（BFP）为来源于水生动物的蛋白，在细胞内表达效率最高，在紫外光的照射激发下，感染重组病毒的细胞发射绿色或蓝色荧光。③插入报告基因后，用药物筛选也就是通过抗性筛选出阳性病毒。这一方法又分为2种，一种是Ecogpt基因的编码产物为黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，感染重组病毒的细胞能在霉酚酸、氨基嘌呤等嘌呤代谢抑制剂存在的条件下生长，感染非重组病毒和未感染细胞则受到抑制；另一种是新霉素磷酸转移酶基因，为抗生素筛选基因，新霉素磷酸转移酶可以对抗生素等进行修饰（磷酸化、乙酰化等），从而使这些抗生素失去对酵母、高等动物等细胞的毒性，以含G-418（庆大霉素氨基糖苷）营养液培养细胞，感染重组病毒的细胞可以生长，感染非重组病毒和未感染细胞则受到抑制（程小文等，2006）。3重组病毒的应用痘病毒已成为普遍的表达载体。它们的应用分为3个领域：①痘病毒分子生物学领域的研究；②体外生产和蛋白质功能化研究；③作为活的疫苗或工具用于疫苗研究。痘病毒的一些属性使痘病毒重组子特别适合用作疫苗。冻干疫苗较稳定、费用低、容易进行生产和使用；疫苗有多种用药途径，接种一次就能获得长期的免疫效果，能诱导抗外来抗原的抗体和细胞毒性T细胞反应。基因组容易组装，允许大片段的基因丢失或删除，以及外源DNA的插入（至少25kb），重组痘病毒疫苗能区分天然感染和接种的动物并与之兼容（Tulman等，2001）。Romero等（1993）构建了一个包含牛瘟病毒（rinderpestvirus）RBOK疫苗株的完整融合蛋白基因（F基因）的重组山羊痘病毒，F基因置于其晚期启动子P11控制下，筛选基因gpt基因置于与P11反向相对的P7.5启动子下方。动物试验结果表明，其疫苗不仅能够保护动物不被毒力较强的牛瘟病毒感染，而且对LSDV的感染也有保护作用。Romero等（1994）构建了一个包含牛瘟病毒RBOK疫苗株的完整H基因的重组山羊痘病毒，血凝素蛋白基因（H基因）置于其晚期启动子P11的控制下。在免疫牛体内能检测到该重组病毒产生的较高水平的牛瘟病毒中和抗体，并且能够保护动物不被致死剂量的毒力较强的牛瘟病毒引起临床感染。使用低于0.1PFU重组病毒的免疫剂量就能够实现保护作用。Romero（1994）用构建完成的分别表达牛瘟病毒的F和H基因的重组病毒用以抵抗小反刍兽疫（pestedespetitsruminants,PPR）的攻击。在免疫过的山羊中，H基因能在其体内产生较高滴度的病毒中和抗体。而F基因产生较少的中和抗体，甚至不能被检测到。和在牛体内所得的试验结果一致。该重组苗除了能同时预防牛瘟和结节性皮炎外，还具有对人无致病性，接触比较安全的优点，不过其缺点是早期存在的抗山羊痘抗体会影响疫苗的效力。WadeEvans等（1996）构建表达了蓝舌病VP7基因的重组羊痘病毒。Aspdcn等（2003）构建表达狂犬病病毒糖蛋白的重组羊痘病毒，作为复制缺陷型疫苗。Berhe等（2003）构建表达小反刍兽疫病毒F基因的重组羊瘟病毒。5结语痘苗病毒用作天花疫苗已有2个世纪的历史，并最终将天花从地球上人为的根除。1982年，重组痘苗病毒表达外源抗原可以在体外建立表达系统及在体内用作活疫苗被证实后，给痘病毒研究者打开了新的视野。近20多年的研究解决了很多与痘病毒载体安全性相关的问题。痘苗病毒被遗传修饰以抑制它的致病性和适应较宽的宿主范围。与此同时，羊痘病毒作为十分安全有效的哺乳类动物载体，将来医学工作者和兽医可以有效地利用这些载体去预防、治疗和消除疾病。作者单位：（1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室，兰州730046；2.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐830052）文章采编：caisy注明：国家科技支撑计划项目（2006BAD06A11；2006BAD06A17）；国家基础平台项目（2005DKA21205-3）
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